Directe inspuiting van kanker afkomstige extracellulaire blaasjes (EVs) leidt tot een herprogrammering van beenmerg, ter ondersteuning van de progressie van de tumor; het is echter onduidelijk welke cellen bemiddelen dit effect. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken EV-gemedieerde tumor-mesenchymale stamcellen (MSC) interacties in vivo, onthullen een cruciale rol voor EV-opgeleide MSCs in metastase.
Communicatie in het tumor bijdragen resident of aangeworven mesenchymale stamcellen (MSCs) tot maligne progressie in meerdere soorten van kanker. Onder invloed van specifieke Milieusignalen, kunnen deze volwassen stamcellen paracrine bemiddelaars leidt tot versnelde tumorgroei en uitzaaiing vrijkomen. Het definiëren van de Overspraak tussen tumor en MSCs is van primair belang voor het begrijpen van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de progressie van kanker en identificeren van nieuwe doelstellingen voor therapeutische interventie.
Kankercellen produceren grote hoeveelheden extracellulaire blaasjes (EVs), die diep van invloed kunnen zijn op het gedrag van de doelcellen in de tumor communicatie of op verre locaties. Tumor EVs omsluiten functionele biomoleculen, met inbegrip van inflammatoire RNAs en (onco) eiwitten, die stromale cellen opleiden kunnen om het metastatische gedrag van kankercellen of deel te nemen aan de vorming van vooraf metastatische niche. In dit artikel beschrijven we de ontwikkeling van een preklinische kanker muismodel waarmee specifieke evaluatie van de EV-gemedieerde Overspraak tussen tumor en de mesenchymale stamcellen. Eerst beschrijven we de zuivering en karakterisering van het EVW tumor-uitgescheiden en de beoordeling van de internalisering van de EV door MSCs. We maken dan gebruik van een multiplex kraal gebaseerde immunoassay te evalueren van de wijziging van het MSC cytokine-expressie profiel geïnduceerd door kanker EVs. Tot slot, we illustreren de generatie van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom die de tumor-MSC interactie recapituleert, en Toon van de bijdrage van MSCs EV-opgeleid tot tumor groei en metastase vorming.
Ons model biedt de mogelijkheid om te definiëren hoe kanker EVs vorm een tumor-ondersteunende omgeving, en te beoordelen of de blokkade van de EV-gemedieerde communicatie tussen tumor en MSCs voorkomt kanker progressie.
De tumor communicatie neemt actief deel aan de meeste, zo niet alle, aspecten van tumorvorming en kanker progressie, met inbegrip van metastase vorming en de ontwikkeling van resistentie tegen therapeutics1. Dit onderstreept de noodzaak van preklinische orthotopic kanker Muismodellen waarmee dissectie van de complexe tumor-stroma-interacties in de niche van de tumor.
Onder de vele cellulaire componenten van de communicatie van de tumor bijdragen mesenchymale stamcellen (MSCs) sterk tot kanker progressie in meerdere soorten kanker zoals kanker van de borst, prostaatkanker, hersentumoren, multiple myeloom en Osteosarcoom2 ,3,4,5,6,7. MSCs zijn multipotente stamcellen, die zich in verschillende volwassen en foetale weefsels bevinden, met inbegrip van het beenmerg, adipeus weefsel, placenta, navelstrengbloed en anderen8,9. In antwoord op kanker gegenereerde inflammatoire signalen, MSCs migreren naar tumor websites integreren in de communicatie van de tumor en uiteindelijk in kanker-ondersteunende cellen10onderscheiden. Deze kanker-geassocieerde MSCs bieden essentiële factoren (dat wil zeggen, groeifactoren, chemokines cytokines en immunosuppressieve bemiddelaars) voor de tumor progressie handelt zowel op tumorcellen en op de omliggende stroma2, 3 , 11 , 12 , 13. terwijl de tumor-bevordering van gevolgen van kanker-geassocieerde MSCs zijn onderzocht in talrijke modellen van de kanker, de mechanismen waardoor tumorcellen MSCs herprogrammeren om de vorm van een kanker-bevordering van niche slecht worden begrepen. Hier beschrijven we de generatie van een orthotopic xenograft model waarmee specifiek de studie van de pro-tumorigene interactie tussen bot kankercellen en MSCs via extracellulaire blaasjes (EVs).
EVW zijn cruciale bemiddelaars van de intercellulaire communicatie tussen tumor en stromale cellen14. EVW voeren functionele biomoleculen van de cel van oorsprong, met inbegrip van eiwitten, lipiden en regelgevende RNAs. Eenmaal uitgebracht in de extracellulaire ruimte, deze blaasjes kunnen worden overgenomen door de omringende cellen of naar verre locaties via het bloed of de lymfatische circulatie, en diep target cel gedrag kunnen beïnvloeden. 15 , 16 , 17 bijvoorbeeld opname van kanker EVs door stromale fibroblasten kan resulteren in myofibroblast differentiatie ondersteunen angiogenese en tumor groei in vivo18,19, internalisering door endothelial versnellen cellen kunnen tumor angiogenese stimuleren en verhogen de vasculaire permeabiliteit16,20, en interactie met immune cellen zou kunnen leiden tot onderdrukking van de antitumorale immuunrespons21.
We onlangs aangetoond, met behulp van een bioluminescente orthotopic xenograft muismodel van osteosarcoom, dat tumorcellen vrij hoge hoeveelheden van het EVW die MSCs prompt te verwerven van een pro-tumorigene en pro-metastatische fenotype. Dit effect is te wijten aan een dramatische verandering in de MSC cytokine-expressie profiel (hierna aangeduid als “MSC onderwijs”), en kan worden voorkomen door de administratie van een therapeutische Interleukine-6 receptor (IL-6R) antilichaam7. Ons werk aangetoond dat kanker EVs cruciale modulatoren van MSC gedrag, waardoor een reden voor communicatie-gerichte benaderingen Osteosarcoom progressie halt toe te roepen. Hierin beschrijven we een stapsgewijze protocol om te onderzoeken de EV-gemedieerde tumor-MSC interactie in vivo. Dit model is bedoeld om: 1) specifiek de kanker EV-geïnduceerde veranderingen van MSC gedrag definiëren in de communicatie van de tumor, 2) evalueren hoe deze interactie bijdraagt aan tumor botgroei en metastase vorming en 3) studie of verstoren de EV-gemedieerde Overspraak in vivo voorkomt dat de progressie van kanker.
Tumor-uitgescheiden extracellulaire blaasjes (EVs) kunnen wijzigen en de Fysiologie van lokale en verre mesenchymale cellen voor het genereren van een tumor-ondersteunende omgeving. Hier beschrijven we de generatie van een preklinische muismodel van osteosarcoom waarmee dissectie van de EV-gemedieerde interacties tussen tumorcellen en mesenchymale stamcellen cellen (MSCs) in vivo. We laten zien dat systemische injectie van menselijke tumor EV opgeleide MSCs in muizen die Osteosarcoom xenografts sterk groei en me…
The authors have nothing to disclose.
S.R. Baglio werd gesteund door een fellowship door Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) medegefinancierd door de Europese Unie. Bovendien heeft dit project ontvangen financiering van de Europese Unie Horizon 2020 programma voor onderzoek en innovatie onder de Marie Sklodowska-Curie-Subsidieovereenkomst geen 660200 (S.R. Baglio).
Equipment | |||||||
Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
-80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
Autoclave | Astell | n.a. | |||||
Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
Culture media | |||||||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
heparin | LEO | 012866-08 | |||||
Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
Cells | |||||||
adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
Disposables | |||||||
Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
Reagents / kits | |||||||
paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
BSA | Sigma | A8412 | |||||
CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
Mice experiments | |||||||
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
Sutures | Ethicon | V926H | |||||
Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |