Прямого впрыска рака производные внеклеточного везикулы (EVs) приводит к перепрограммирования костного поддержки прогрессии опухоли; Однако какие клетки посредником этот эффект является неясным. Здесь мы опишем пошаговое протокол расследовать EV-опосредованной опухоли мезенхимальных стволовых клеток (МСК) взаимодействия в естественных условиях, раскрывая решающую роль для EV-образованных MSCs метастаз в.
В рамках микроокружения опухоли резидент или набранных мезенхимальных стволовых клеток (МСК) способствовать злокачественные прогрессии в нескольких типов рака. Под влиянием конкретных экологических сигналов эти стволовые клетки могут выпустить паракринными посредников ведет к ускоренному опухолевого роста и метастазирования. Определение перекрестных помех между опухолью и MSCs имеет первостепенное значение, чтобы понять механизмы, лежащие в основе прогрессии рака и определить новые цели для терапевтического вмешательства.
Раковые клетки производят большое количество внеклеточного везикулы (EVs), которые может глубоко повлиять на поведение клеток-мишеней в микроокружения опухоли или на удаленных объектах. Опухоль EVs заключите функциональных биомолекул, включая воспалительных молекул РНК и белков (онко), которые могут обучать стромальные клетки для повышения метастатического поведение раковых клеток или участвовать в формировании предварительно метастатического нишу. В этой статье мы опишем разработки модели мыши доклинических рака, которая позволяет конкретной оценки EV-опосредованной перекрестных помех между опухолью и мезенхимальных стволовых клеток. Во-первых мы описываем, очистки и характеристика опухоли выделяется EVs и оценки EV интернализации поддерживается MSCs. Мы затем сделать использования мультиплексной иммуноферментного анализа на основе бисера для оценки изменения профиля выражение cytokine MSC вызванных раком EVs. Наконец мы иллюстрируют поколения модели мыши ксенотрансплантата биолюминесцентных ортотопическая остеосаркома, резюмирует опухоль MSC взаимодействия и показать вклад EV-образованных MSCs для формирования роста и метастазирования опухоли.
Наша модель предоставляет возможность определить, как рак EVs сформировать опухоль поддержка окружающей среды и оценить ли блокады EV-опосредованной коммуникации между опухолью и MSCs предотвращает прогрессирование рака.
Микроокружения опухоли активно участвует в большинстве, если не все, аспекты опухолей и рака прогрессии, в том числе метастаз формирование и развитие резистентности к терапии1. Это подчеркивает необходимость доклинические ортотопическая рака мыши модели, которые позволяют рассечение взаимодействия сложных опухоли стромы, происходящих в нише опухоли.
Среди многих клеточных компонентов микроокружения опухоли мезенхимальных стволовых клеток (МСК) сильно способствуют прогрессии рака в нескольких типов рака, таких как рак молочной железы, рак простаты, опухоли мозга, множественной миеломы и остеосаркома2 ,3,4,5,6,7. MSCs, Multipotent с экстрактами стволовых клеток, которые находятся в различных тканях взрослого и плода, включая костный мозг, жировой ткани, плаценты, пуповинной крови и другие8,9. В ответ на воспалительные сигналы, генерируемые рака MSCs миграции к местам опухоль, включить в микроокружения опухоли и в конечном дифференцируются в поддержку рак клеток10. Эти рака связанные MSCs обеспечивают существенные факторы (например, факторы роста, chemokines, цитокинов и иммуносупрессивные посредников) для прогрессии опухоли, действуя как на опухолевые клетки, так и на окружающих стромы2, 3 , 11 , 12 , 13. Хотя опухоль повышая влияния связанных рака MSCs исследованы в многочисленных рака моделей, механизмов, которыми опухолевых клеток перепрограммировать MSCs сформировать рак содействия нишу плохо понимают. Здесь мы описываем поколения модели ксенотрансплантата ортотопическая, которая конкретно позволяет исследование про онкогенной взаимодействия между кости раковые клетки и MSCs через внеклеточного везикулы (EVs).
EVs это решающее посредники межклеточные связи между опухолью и стромальных клеток14. EVs нести функциональные биомолекул ячейки происхождения, включая белки, липиды и регулирования РНК. Попав в внеклеточного пространства, эти пузырьки могут приниматься окружающие клетки или в отдаленные участки через кровь или лимфатическую циркуляцию и может глубоко повлиять на поведение целевой ячейки. 15 , 16 , 17 например, поглощение рака EVs фибробласты стромы может привести к Миофибробласт дифференциации поддержки ангиогенеза и ускорения опухолевого роста в vivo18,19, интернализации, эндотелиальных клетки могут стимулировать ангиогенез опухоли и повышение сосудистой проницаемости16,20, и взаимодействие с клетки иммунной системы может привести к подавлению противоопухолевый иммунный ответ21.
Мы недавно отмечали, используя модель мыши ксенотрансплантата биолюминесцентных ортотопическая остеосаркома, что опухолевые клетки освободить большое количество EVs, запрашивающие MSCs приобрести онкогенной pro и pro метастатическим фенотип. Этот эффект обусловлен драматические изменения в профиле выражение cytokine MSC (упоминаемые как «MSC образование») и могут быть предотвращены путем отправления антитела терапевтических рецептор интерлейкина-6 (IL-6R)7. Наша работа показали, что рак EVs решающую модуляторы MSC поведения, обеспечивая тем самым обоснование микроокружения ориентированных подходов к прекращению прогрессии остеосаркома. Здесь мы опишем пошаговое протокол расследовать EV-опосредованной опухоли MSC взаимодействия в естественных условиях. Эта модель предназначена для: 1) конкретно определить EV-индуцированных изменений рака MSC поведения микроокружения опухоли, 2) оценить, как это взаимодействие способствует рост опухоли костей и образование метастазов и 3) исследования ли вмешиваться EV-опосредованной перекрестных помех в vivo предотвращает прогрессирование рака.
Опухоль выделяется внеклеточного везикулы (EVs) могут изменить физиологии местного и дальнего мезенхимальных клеток сформировать опухоль благоприятных условий. Здесь мы описываем поколения доклинических мыши модель остеосаркома, что позволяет рассечение EV-опосредованного взаимодей?…
The authors have nothing to disclose.
Baglio с.р. была поддержана стипендии по Associazione Italiana за Ла Ricerca Сул Cancro (АКПО) финансируется Европейским союзом. Кроме того этот проект получил финансирование от Европейского союза Horizon 2020 программы исследований и инноваций под Марии Склодовской-Кюри грантовое соглашение не 660200 (в Baglio с.р.).
Equipment | |||||||
Ultra Centrifuge | Beckman | Optima L-90K | |||||
Rotor SW32Ti | Beckman | 369650 | Referred to in the manuscript as ultra-swinging bucket rotor | ||||
Transmission electron microscope | Zeiss | EM109 | Or similar TEM | ||||
Digital camera | Nikon | DMX 1200F | Or similar camera | ||||
Imaging software TEM | Nikon | ACT-1 | |||||
Fluorescence microscope | Zeiss | Imager.D2 | Or similar Fluorescence microscope | ||||
Imaging software FM | Zeiss | ZEN Blue | |||||
Incubator | Nuaire | 4750E | |||||
Centrifuge | Hettick | ROTANTA 460R | |||||
-80 Freezer | Thermo electro corporation | n.a. | |||||
FACS | BD | BD FACScalibur | Or similar flow cytometer | ||||
Drill | Ferm | FCT-300 | With 0.8 mm drill | ||||
HSS micro twist drills, 0.8 mm | Proxxon | 28 852 | 0.8 mm drill | ||||
IVIS camera | Xenogen | Ivis Lumina | Referred to in the manuscript as bioluminescence camera. Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
Living image software2.60 | Xenogen / Igor Por | n.a | Xenogen is now part of Perkin Elmer | ||||
10 µL Syringe | Hamilton | Neuros Model 1701 RN | |||||
Needle: Hamilton RN Needle for Syringe, 26 Gauge, Pointstyle AS, custom length 2 cm | Hamilton | n.a. | |||||
Caliper | Mitutoyo | G08004463 | |||||
Autoclave | Astell | n.a. | |||||
Heat Lamp | Philips | n.a. | |||||
Culture media | |||||||
Fetal Bovine Serum | Hyclone | RYG35912 | |||||
Platelet Lysate | n.a. | n.a. | |||||
IMDM medium | Lonza | BE12-722F | |||||
alpha-MEM medium | Lonza | BE02-002F | |||||
DMEM medium | Lonza | BE12-614F | |||||
pen/strep/glutamine | GIBCO | 10378-016 | |||||
heparin | LEO | 012866-08 | |||||
Trypsin/EDTA (10x) | GIBCO | 15400-054 | |||||
Cells | |||||||
adipose deriverd MSCs | n.a. | n.a. | |||||
GFP-positive MSCs | n.a. | n.a. | |||||
human fibroblasts | n.a. | n.a. | |||||
143B cells | ATCC | CRL-8303 | |||||
FLUC-143B cells | ATCC | CRL-8303 | Transduced | ||||
Disposables | |||||||
Culture flasks 175 cm2 | CELLSTAR | 660175 | |||||
50 mL tubes | Greiner bio-one | 210261 | |||||
Freeze tubes | Thermoscientific | 377224 | |||||
Ultra-Clear tubes | Beckman | 344058 | Referred to in the manuscript as ultra-centrifuge tubes | ||||
0,22 µm filter | Millex | SLGV033RS | |||||
200 mesh Formvar-carbon-coated nickel grids | EMS (Electron Microscopy Sciences) | ||||||
0.5 mL insulin syringes with 29G Needle | Terumo | U-100 | |||||
Petri dish | Sigma – Aldrich | P7612 | |||||
Filter paper | Thermo fisher Scientific | 50363215 | |||||
Reagents / kits | |||||||
paraformaldehyde | Alfa Aeser | 43368.9M | |||||
PBS | Braun | 220/12257974/110 | |||||
glutaraldehyde | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 16300 | |||||
uranyl oxalate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22510 | |||||
urany acetate | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 22400 | |||||
methyl cellulose | EMS (Electron Microscopy Sciences) | 1560 | |||||
PKH67 | Sigma | mini67-1kt | Referred to in the manuscript as GFLD | ||||
BSA | Sigma | A8412 | |||||
CBA – human inflammatory cytokine kit | BD | 551811 | |||||
Formaldehyde 37% | VWR | 104003100 | |||||
Carbon Steel surgical blades | Swann-Morton | 206 | Referred to in the manuscript as surgical knife | ||||
anti-human vimentin antibody | Santa Cruz | sc-6260 | Clone V9 | ||||
Antibody diluent | DAKO | S0809 | |||||
HRP-labeled anti mouse IgG antibody | Life Technologies | 32230 | |||||
DAB-kit | DAKO | K500711 | |||||
hematoxyllin | Sigma | GHS232 | |||||
EDTA-buffer | n.a. | n.a. | |||||
Citrate buffer | n.a. | n.a. | |||||
rabbit polyclonal anti-GFP antibody | Abcam | n.a. | Ab290 | ||||
DAPI | Life Technologies | D1306 | |||||
Paracetamol, 120 mg / 5 ml syrup | Bayer | n.a. | Sinaspril, paracetamol solution for kids | ||||
Isoflurane 1000 mg/g | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
buprenofine hydrochloride, 0.3 mg/ml | Indivior UK Limited | n.a. | |||||
lidocaine-HCL 2% | Vumc pharmacy | n.a. | |||||
70% ethanol | VWR | 93003.1006 | |||||
Tissue glue | Derma+Flex, formulated medical cyanoacrylate | Vygon | LB604060 | ||||
Eyedrops: Vidisec Carbogel, 2 mg/ml | Bausch+Lomb | n.a. | |||||
D-luciferin, potassium salt | Gold Biotechnology | LUCK-1 | |||||
Glass slides | Thermo scientific | 630-0954 | |||||
Stainless steel loops | n.a. | n.a. | |||||
Mice experiments | |||||||
Mice, Hsd:Athymic Nude-Foxn1nu, female, 6 weeks at arrival, bacterial status conform FELASA | ENVIGO | n.a. | |||||
Paper-pulp smart home (cage enrichment) | Bio Services | n.a. | |||||
Alpha-dri bedding material | Shepperd Speciality Papers | n.a. | |||||
Mouse food: Teklad global 18% protein rodent diet | ENVIGO | 2918-11416M | |||||
Sutures | Ethicon | V926H | |||||
Scissors | Sigma-Aldrich | S3146-1EA | (or similar) | ||||
Tweezers | Sigma-Aldrich | F4142-1EA | (or similar) |