Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor
Summary
Este protocolo sirve como un esquema para establecer un sistema funcional de Tet-ON en líneas celulares de cáncer y su posterior utilización, en particular para estudiar el papel de proteínas derivadas de células de tumor en el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor.
Abstract
siRNA y shRNA-mediada derribar los métodos de regulación de la expresión génica (KD) son herramientas muy valiosas para entender la función del gen y proteína. Sin embargo, en el caso que la KD de la proteína de interés tiene un efecto letal sobre las células o el efecto esperado del KD es dependiente del tiempo, incondicionales métodos KD no son apropiados. Sistemas condicionales son más adecuados en estos casos y han sido objeto de mucho interés. Estos incluyen sistemas de sobreexpresión de ecdisona-inducible, citocromo P-450 inducción sistema1, y la tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes.
El sistema de expresión de gene de tetraciclina regulado permite control reversible sobre la expresión de la proteína por la inducción de expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina. En este protocolo, se presenta un diseño experimental utilizando sistema Tet-ON funcional en líneas celulares de cáncer humano condicional regulación de la expresión génica. Entonces se demuestra el uso de este sistema en el estudio de la interacción monocito célula de tumor.
Introduction
Los macrófagos asociados tumor (TAMs) contribuyan al desarrollo de tumor por promover el crecimiento del tumor, metástasis y regular la respuesta inmune2. Cáncer células inflamatorias monocitos recluta, que infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs3. Infiltración del tumor con TAMs correlaciona con mala evolución clínica y se ha relacionado con la función inmunosupresora de macrófagos4,5. Sin embargo, los mecanismos del reclutamiento de macrófagos que el tumor no se exploraron bien y una mejor comprensión de los caminos implicados es crucial para más adelanto del campo y prometedoras terapias. Uno de los retos en el estudio de las interacciones entre las células tumorales y células normales en el microambiente del tumor (TME) es la complejidad de los mecanismos y las células involucradas, que requieren enfoques en vitro que permiten la disección de la diafonía. Aquí presentamos una metodología versátil que puede ser aplicada para estudiar el efecto paracrino de un cáncer derivado de la célula, la proteína secretada sobre la migración de otros tipos celulares como macrófagos, en vitro. Utiliza un sistema donde la expresión de shRNA contra una cáncer derivado de células proteína que participa en el reclutamiento de monocitos está bajo el control del promotor inducible por tetraciclina, se cuantificaron el efecto paracrino de la proteína secretada en monocitos. En el presente Protocolo, la clonación de secuencias de shRNAs en la tetraciclina se presenta regulado vector seguido por generación de líneas celulares de cáncer estable. Además, la purificación de monocitos humanos primarios y un análisis de la cámara de Boyden se utilizan para analizar el efecto paracrino de una proteína de la célula de cáncer derivada sobre la migración de monocitos.
Downregulation de proteína codificación genes comúnmente se aplica con técnicas de siRNA y shRNA, aunque no sin limitaciones en su uso. La precipitación a largo plazo (KD) de genes puede provocar secundarias respuestas adaptativas de las células que interfieren con los resultados experimentales. Falta de control temporal sobre expresión génica hace difícil estudiar el papel dinámico de una proteína con el tiempo o el papel de una proteína crucial para la supervivencia de la célula. Esta cuestión es especialmente importante en entornos en vivo , donde el papel de una proteína en el desarrollo del tumor y la progresión podría requerir regulación a la baja de la expresión de la proteína de interés sólo después de establecido el tumor. KD condicional tiene la ventaja de evitar un pronto efecto letal del KD en las células y para permitir el análisis del papel de la proteína en diferentes etapas de crecimiento del tumor, mientras que KD incondicional podría resultar en la falta de desarrollo del tumor.
Un número de sistemas condicionales de KD se han desarrollado para abordar las limitaciones de la KD estable. Los sistemas de expresión génica condicional incluyen ecdisona-inducible sobreexpresión sistemas, el sistema de inducción de citocromo P-450 de1, y tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes. Los sistemas de expresión de genes regulados por tetraciclina permiten control sobre la expresión de shRNAs sobre adición de antibiótico tetraciclina (o su análogo más estable – doxiciclina). En Tet-sobre los sistemas, se induce la expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina/doxiciclina dando lugar a una expresión génica KD, mientras que en los sistemas de Tet-OFF, se suprime la expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina que resulta en la expresión génica. Una desventaja del sistema inducible por tetraciclina es previamente divulgados bajos niveles de expresión de shRNAs en ausencia de doxiciclina – supuesta filtración6,7. En el Tet-sistema descrito aquí, sobre la administración de la tetraciclina, la Unión de la proteína represora (TET) de tetraciclina constitutivamente expresada a la Tet respuesta secuencia de elemento (TRE) dentro de la H1 es la región del promotor de shRNAs de interés suprimió. Esto resulta en la expresión de shRNA y la inhibición de la traducción de la proteína de interés en una manera dependiente de la tetraciclina8,9.
Otros sistemas de Tet-ON disponibles incluyen simultánea knock-in del TetO secuencia entre la caja TATA y el elemento de secuencia proximal (PSE) y entre transcripción y caja TATA Inicio Sitio desarrollado por Chan et al. 10 este sistema requiere menos dosis tóxicas de tetraciclina para regular la expresión del shRNA, sin embargo, bajo un estado de no inducido, niveles bajos de shRNA se expresan. La caja asociada a Krüppel (Cascarudo) basado en Tet-ON system11 incluye KRAB, una proteína dedo de zinc, que temas genes situados dentro de un rango de 3 kb del sitio de unión de KRAB supresión transcripcional. La tTRKRAB de la proteína quimérica puede enlazar a TetO, y debido a la amplia gama de capacidad controlable de ADN, TetO no necesita ser limitada entre la transcripción comienzan sitio y el promotor y tiene bajo impacto sobre la actividad del promotor. Bajo estado no inducida, informó de este sistema controlable de interferencia de RNA para mostrar un menor nivel de expresión se filtró de shRNAs11,12; sin embargo, requiere un enfoque alternativamente, dos vectores de clonación. En comparación con sistemas de KD condicionales previamente desarrollados como el sistema inducible por la ecdisona de sobreexpresión o sistema de inducción de citocromo P-450, sistema reglamentado de tetraciclina tiene la ventaja de su robustez y su reversibilidad y por lo tanto es la más habitualmente utilizada sistema13. El sistema utilizado en el presente Protocolo tiene la ventaja sobre el TetO doble knock-en sistema y KRAB Tet-ON requiere vector recto hacia adelante, solo la clonación, que permite la generación rápida de múltiples clones, y presenta niveles muy bajos de filtración en la ausencia de doxiciclina.
TME es fundamental para el desarrollo del cáncer. Para facilitar el crecimiento del tumor, las células de cáncer reclutan monocitos inflamatorios secretando proteínas quimiotácticas. Monocitos reclutados infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs que contribuyen al crecimiento del tumor y la metástasis. Estudios in vitro del reclutamiento de células inmunes utilizan ensayos de migración, con Boyden, ensayo de cámara siendo ampliamente usado14,15,16,17. En este ensayo, la fuente de proteína chemoattractant, por ejemplo, las células cancerosas, o una proteína purificada, se coloca en la cámara inferior. Las células inmunes se colocan en el compartimiento superior separado por membrana porosa del compartimiento inferior. Las células migran hacia el gradiente de aumento de chemoattractant y los que se encuentran en la parte inferior de la membrana son manchadas y contaron con el microscopio. Aquí probamos la chemoattractant función de inhibidor de activador del plasminógeno 1 (PAI-1) en monocitos mediante la generación de líneas celulares de cáncer estable, inducible en expresión de PAI-1 es regulada por la adición de doxiciclina. Utilizamos monocitos humanos primarios en el ensayo de migración cámara de Boyden para evaluar el papel de PAI-1 en la migración de monocitos. Diferencias entre monocitos humanos primarios y líneas de células monocytic ampliamente utilizado como THP1 han divulgado y son de patrones de expresión de citoquinas diferentes18; por ejemplo, 5-10 veces aumento en los niveles de expresión de TNF-α por las células THP1 comparado con monocitos humanos19. Las células THP1 se derivan de las células monocytic de la leucemia humana, son fáciles de mantener y proliferan con una media de tiempo de 19-50 h20de duplicación. Por el contrario, los monocitos humanos se caracterizan por una vida corta en ausencia de factores de crecimiento. Desde monocitos son purificados de sangre de los donantes, una gran cantidad de variabilidad que se produce entre los individuos y según el método de purificación, puede producirse la contaminación con otros tipos de células. Sin embargo, los monocitos primarios son relevantes y se ha recomendado utilizar o confirmar los resultados obtenidos con las líneas de células monocytic en monocitos primarias de investigación biológica19. Aquí se describe un protocolo para la purificación de monocitos humanos primarios de la sangre periférica. Otros métodos de purificación de monocitos son protocolos de densidad gradiente y adherencia y procedimiento de dos pasos con solo gradientes de Ficoll-Hypaque, seguido de un gradiente de Percoll21. La pureza de la población de monocitos obtenida por esas gamas de métodos entre 70-90%. El método descrito aquí utiliza un gradiente de densidad, seguido de una selección negativa inmune22 y permite la purificación de monocitos humanos sin contacto directo con los anticuerpos, así evitando su activación accidental y resultando en un > 95% de la población pura de monocitos.
El protocolo presentado aquí se utiliza para establecer un sistema funcional de Tet-ON para expresión génica KD en líneas celulares de cáncer humano para estudiar el efecto de chemoattractant del cáncer secretan la proteína derivada del PAI-1 en monocitos. PAI-1 se sobre expresa por una variedad de tumores y paradójicamente, su expresión se correlaciona con resultado clínico pobre23,24. El papel pro-tumorigenic de PAI-1 es el resultado de su pro-angiogénicos y anti-apoptotic funciones25,26. PAI-1 se ha demostrado para contribuir a los inflamación promoviendo el reclutamiento de macrófagos al sitio de inflamación27. PAI-1 fue demostrado para promover el músculo liso cellmigration28,29 y a participar en el Mac-1 dependiente macrófago migración30. Sobre-expresión de PAI-1 también ha demostrado mejorar significativamente el reclutamiento de macrófagos Raw 264.7 en de los tumores de melanoma B16F1031. Sin embargo, el papel de PAI-1 en la migración de TAM no ha sido investigado en detalle. Utilizamos el protocolo descrito para responder a la pregunta de si el PAI-1 atrae monocitos a las células cancerosas. Esta metodología permite la disección de la diafonía entre tumor y TME por silenciar la proteína secretada en las células del cáncer y analizar los componentes de lo TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Compuesto por una variedad de tipos celulares, la TME es crucial para el desarrollo del cáncer. Para determinar las condiciones de crecimiento óptimo, las células cancerosas atraen monocitos a través de la secreción de factores quimiotácticos. Aquí presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo de reclutamiento de monocitos por células tumorales en vitro. Para ello, se utiliza una combinación de sistema de expresión inducible gene, purificación de monocitos humanos primarios y como un ejemplo de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean reconocer Jacqueline Rosenberg para corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los nosotros Departamento de salud y servicios humanos/nacional institutos de salud con una subvención YA DeClerck (concesión 5R01 CA 129377) y la TJ Martell Foundation. MH Kubala es el receptor de un premio de beca de desarrollo de carrera de investigación del Instituto de investigación de Saban en el Hospital Los Angeles de los niños.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
