Atterramento condizionale dell'espressione genica in linee cellulari del cancro per studiare il reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale
Summary
Questo protocollo serve come uno schema per istituire un sistema funzionale di Tet-ON in linee cellulari del cancro e la successiva utilizzazione, in particolare per studiare il ruolo di proteine derivati da cellule tumorali nel reclutamento dei monociti/macrofagi al microambiente tumorale.
Abstract
siRNA e abbattere shRNA-mediata di metodi (KD) di regolazione dell’espressione genica sono strumenti preziosi per capire la funzione genica e proteica. Tuttavia, nel caso che il KD della proteina di interesse ha un effetto letale sulle cellule o l’effetto atteso di KD è dipendente dal tempo, incondizionati KD metodi non sono adatti. Sistemi di condizionale sono più adatte in questi casi e sono state oggetto di grande interesse. Questi includono sistemi di sovraespressione ecdisone-inducibile, citocromo P-450 induzione sistema1, e la tetraciclina regolato sistemi di espressione genica.
Il sistema di espressione del gene di tetraciclina regolamentato consente un controllo reversibile l’espressione della proteina di induzione dell’espressione di shRNA in presenza di tetraciclina. In questo protocollo, vi presentiamo un progetto sperimentale utilizzando sistema Tet-ON funzionale in linee cellulari tumorali umane per condizionale regolazione dell’espressione genica. Dimostriamo quindi l’uso di questo sistema nello studio dell’interazione delle cellule-monociti del tumore.
Introduction
Macrofagi tumore associato (TAMs) contribuiscono allo sviluppo del tumore, promuovendo la crescita del tumore, metastasi e che regolano la risposta immunitaria2. Le cellule tumorali infiammatorie monociti recluta, che infiltrano il tumore e differenziano in pro-cancerogeno TAMs3. Infiltrazione del tumore con TAMs correla con risultato clinico difficile ed è stato collegato al ruolo immunosopressivo di macrofagi4,5. Tuttavia, i meccanismi del reclutamento dei macrofagi di tumore non sono ben esplorati e una migliore comprensione delle vie coinvolte è cruciale per l’ulteriore avanzamento del campo e promettenti terapie. Una delle sfide nello studiare le interazioni tra cellule tumorali e cellule normali nel microambiente tumorale (TME) è la complessità dei meccanismi e cellule coinvolte, che richiedono approcci in vitro che consentono la dissezione del crosstalk. Qui presentiamo una metodologia versatile che può essere applicata per studiare l’effetto di paracrine di un cancro cellula-derivato, proteina secernuta sulla migrazione di altri tipi di cellule come i macrofagi, in vitro. Utilizza un sistema in cui l’espressione di shRNA contro una cellula-derivati dalla proteina del cancro coinvolta nel reclutamento dei monociti è sotto il controllo del promotore inducibile tetraciclina, è quantificato l’effetto paracrino della proteina secernuta sui monociti. In questo protocollo, clonazione delle sequenze shRNA nella tetraciclina regolamentato vettoriale è presentato seguita dalla generazione di linee cellulari tumorali stabile. Inoltre, la purificazione di monociti umani primari e un’analisi della camera di Boyden vengono utilizzati per analizzare l’effetto di paracrine di una proteina della cellula tumorale derivata sulla migrazione dei monociti.
Downregulation dei geni di codificazione della proteina è comunemente applicato con tecniche di siRNA e shRNA, anche se non senza limitazioni nel suo utilizzo. Il knock-down a lungo termine (KD) di geni può suscitare risposte adattative secondarie delle cellule che interferiscono con i risultati sperimentali. Mancanza di controllo temporale sull’espressione genica rende impegnativo per studiare il ruolo dinamico di una proteina nel tempo o il ruolo di una proteina fondamentale per la sopravvivenza delle cellule. Questo problema è particolarmente importante nelle impostazioni di in vivo , dove il ruolo di una proteina nello sviluppo del tumore e nella progressione potrebbe richiedere downregulation dell’espressione della proteina di interesse solo dopo che il tumore è stabilito. KD condizionale ha il vantaggio di evitare un effetto letale troppo presto di KD sulle cellule e per attivare l’analisi del ruolo della proteina all’interno di diverse fasi di crescita del tumore, mentre KD incondizionato potrebbe causare mancanza di sviluppo del tumore.
Un numero di condizionale KD sistemi è stato sviluppato per risolvere le limitazioni di KD stabile. I sistemi di espressione genica condizionale includono sistemi di sovraespressione ecdisone-inducibile, sistema induzione del citocromo P-4501, e tetraciclina regolato sistemi di espressione genica. I sistemi di espressione di gene tetraciclina-regolato consentono di controllare l’espressione di shRNA con l’aggiunta della tetraciclina antibiotica (o il suo analogo più stabile – doxiciclina). Nei sistemi di Tet-ON, l’espressione di shRNA è indotta in presenza di tetraciclina/doxiciclina risultante in un’espressione genica KD, mentre nei sistemi di Tet-OFF, l’espressione di shRNA è soppressa in presenza di tetraciclina conseguente espressione genica. Uno svantaggio del sistema tetraciclina-inducibile è precedentemente segnalati a bassi livelli di espressione di shRNA in assenza di doxiciclina – cosiddetto permeabilità6,7. Tet-on sistema descritto qui, somministrazione di tetraciclina, il legame della proteina repressore (TetR) tetraciclina costitutivamente espressa per la sequenza di elementi (TRE) Tet-sensible a reagire all’interno il H1 regione del promotore di shRNA di interesse è soppresso. Questo si traduce in espressione di shRNA e inibizione della traduzione della proteina di interesse in un modo dipendente dalla tetraciclina8,9.
Altri sistemi di Tet-ON disponibili includono knock-in simultanea di TetO sequenza tra TATA box ed elemento sequence prossimale (PSE) e tra trascrizione e TATA box avviare sito sviluppato da Chan et al. 10 questo sistema richiede meno di dosi tossiche di tetraciclina di regolare l’espressione di shRNA, tuttavia, in uno stato indotto non, bassi livelli di shRNA vengono espressi. La casella Krüppel-collegata (KRAB) basato Tet-ON sistema11 include KRAB, una proteina del dito di zinco, che geni soggetti si trovano all’interno di una gamma di 3 kb del sito di legame di KRAB a soppressione trascrizionale. TTRKRAB la proteina chimerica può associare a TetO, e dovuto la vasta gamma di capacità controllabile del DNA, TetO non bisogno essere limitato tra la trascrizione aprire il sito e il promotore hanno basso impatto sull’attività del promotore. Sotto lo stato indotto non, questo sistema di interferenza RNA controllabile è stato segnalato per mostrare un livello inferiore di trapelate espressione di shRNA11,12; Tuttavia, esso richiede un approccio sequenza, due-vettore di clonazione. Rispetto ai sistemi di KD condizionale precedentemente sviluppati come il sistema di sovraespressione ecdisone-inducibile o sistema di induzione del citocromo P-450, il sistema di tetraciclina-regolato ha il vantaggio della sua robustezza e la reversibilità e pertanto è il più usato ordinariamente sistema13. Il sistema utilizzato in questo protocollo ha il vantaggio rispetto il KRAB Tet-ON sistema e TetO knock-in sistema duale in quanto richiede dritto in avanti, singolo vettore clonazione, permettendo la rapida generazione di più cloni, e presenta livelli molto bassi di permeabilità nella assenza di doxiciclina.
TME è fondamentale per lo sviluppo del cancro. Per facilitare la crescita del tumore, le cellule tumorali reclutano infiammatori monociti secernendo proteine chemiotattiche. Reclutati monociti infiltrano il tumore e differenziano in tam pro-cancerogeno che contribuiscono alla crescita del tumore e metastasi. Studi in vitro del reclutamento delle cellule immuni utilizzano saggi di migrazione, con Boyden analisi della camera essendo ampiamente usato14,15,16,17. In questa analisi, la fonte della proteina chemoattractant, ad esempio, le cellule tumorali, o una proteina purificata, viene inserita nella camera inferiore. Le cellule immunitarie sono collocate nella camera superiore separata con membrana porosa dal vano inferiore. La migrazione verso la pendenza crescente di chemoattractant e quelli che si trovano sul lato inferiore della membrana di cellule sono macchiate e conteggiate sotto il microscopio. Qui testiamo la funzione chemoattractant del Plasminogen Activator Inhibitor 1 (PAI-1) sui monociti generando linee cellulari stabili, inducibile cancro dove espressione di PAI-1 è regolata da aggiunta di doxiciclina. Utilizziamo monociti umani primari in analisi migrazione dell’alloggiamento di Boyden per valutare il ruolo di PAI-1 in migrazione di monociti. Differenze tra linee cellulare monocytic ampiamente usato come THP1 e monociti umani primari sono state segnalate e includono diverse citochine espressione modelli18; ad esempio, aumento di 5-10 volte nei livelli di espressione di TNF-α dalle cellule THP1 rispetto ai monociti umani19. Le cellule THP1 sono derivati da cellule monocytic umane di leucemia, sono facili da mantenere e proliferare con una media di 19-50 h20il tempo di raddoppiamento. Al contrario, monociti umani sono caratterizzati da una durata breve in assenza di fattori di crescita. Dal momento che i monociti sono purificati dal sangue dei donatori, una discreta quantità di variabilità si verifica tra gli individui e a seconda del metodo di purificazione, può verificarsi la contaminazione con altri tipi di cellule. Tuttavia, monociti primari sono rilevanti ed è stato raccomandato di utilizzare o confermare i risultati ottenuti con le linee di cellule monocytic utilizzando monociti primari nella ricerca biologica19. Qui descriviamo un protocollo per la purificazione dei monociti umani primari da sangue periferico. Metodi alternativi di purificazione del monocito sono protocolli di adesione e del gradiente di densità e procedura di due step con singoli gradiente di Ficoll-Hypaque seguita da un gradiente di Percoll21. La purezza della popolazione monocito ottenuta da quelle gamme di metodi tra 70-90%. Il metodo qui descritto utilizza un gradiente di densità seguito da una selezione negativa immuni22 e permette la purificazione dei monociti umani senza contatto diretto con gli anticorpi, quindi evitando loro attivazione accidentale e conseguente un > 95% della popolazione di puro dei monociti.
Il protocollo presentato qui è utilizzato per l’impostazione di un sistema funzionale di Tet-ON per l’espressione genica KD in linee cellulari tumorali umane per studiare l’effetto di chemoattractant della proteina secernuta cancro-derivato PAI-1 sui monociti. PAI-1 è overexpressed da una varietà di tumori e la sua espressione paradossalmente correla con risultato clinico difficile23,24. Il ruolo pro-cancerogeno di PAI-1 è un risultato della sua pro-angiogenici e anti-apoptotici funzioni25,26. PAI-1 ha dimostrato di contribuire alla infiammazione promuovendo l’assunzione dei macrofagi al sito di infiammazione27. PAI-1 è stata indicata per promuovere il muscolo liscio cellmigration28,29 e a partecipare al Mac-1 dipendente del macrofago migrazione30. Sovraespressione di PAI-1 ha dimostrata anche di migliorare significativamente l’assunzione dei macrofagi Raw 264.7 in B16F10 del melanoma tumori31. Tuttavia, il ruolo di PAI-1 in migrazione TAM non è stato studiato in dettaglio. Utilizziamo il protocollo descritto per rispondere alla domanda di se PAI-1 attrae i monociti alle cellule tumorali. Questa metodologia consente una dissezione del crosstalk tra tumore e TME silenziamento la proteina secernuta in cellule tumorali ed analizzando le componenti della TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Composto da una varietà di tipi cellulari, la TME è cruciale per lo sviluppo del cancro. Per accertare le condizioni di crescita ottimali, le cellule tumorali attraggono i monociti attraverso la secrezione di fattori chemiotattici. Qui presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo di reclutamento di monociti di cellule tumorali in vitro. A tale scopo, viene utilizzata una combinazione di sistema di espressione genica viscoelastica, purificazione dei monociti umani primari e come esempio di un test di mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare Jacqueline Rosenberg per la correzione del manoscritto. Questo lavoro è stato supportato da l’US Department of Health and Human Services/National Institutes of Health con una sovvenzione di YA DeClerck (concedere 5R01 CA 129377) e la Fondazione di Martell TJ. Kubala MH è il destinatario di un premio di sviluppo di carriera di ricercatrice dell’Istituto di ricerca Saban a bambini Hospital Los Angeles.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
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