Knockdown conditionnel de l’Expression génique dans les lignées de cellules cancéreuses pour étudier le recrutement des Monocytes/Macrophages pour le microenvironnement tumoral
Summary
Ce protocole sert un régime pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses et leur utilisation ultérieure, en particulier pour étudier le rôle des protéines de culture cellulaire tumorale dans le recrutement des monocytes/macrophages pour le microenvironnement tumoral.
Abstract
siARN et médiation shARN démantelez méthodes (KD) de régulation de l’expression des gènes sont des outils précieux pour comprendre la fonction de gènes et des protéines. Toutefois, dans le cas que le KD de la protéine d’intérêt a un effet létal sur les cellules ou les effets anticipés de la KD sont dépendante du temps, inconditionnels des méthodes KD ne conviennent pas. Conditionnelles systèmes conviennent mieux dans ces cas et ont fait l’objet de beaucoup d’intérêt. Il s’agit de systèmes de surexpression inductible par l’Ecdysone, Cytochrome P-450 induction système1, et la tétracycline régulé systèmes d’expression de gène.
Le système d’expression de gène tétracycline réglementé permet contrôle réversible surexpression de la protéine par induction de l’expression de shARN en présence de tétracycline. Dans ce protocole, nous présentons un modèle expérimental à l’aide de système fonctionnel de Tet-ON dans les lignées cellulaires cancéreuses humaines conditionnelle règlement d’expression de gène. Ensuite, nous montrent l’utilisation de ce système dans l’étude de l’interaction cellule-monocyte tumeur.
Introduction
Macrophages (EAPV) de la tumeur associée contribuent au développement de la tumeur en favorisant la croissance des tumeurs, métastases et régulation de la réponse immunitaire2. Monocytes inflammatoire recrue, qui infiltrent la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs3en cellules cancéreuses. Infiltration de la tumeur avec TAMs est en corrélation avec des résultats cliniques pauvres et a été liée au rôle immunosuppresseur sur les macrophages4,5. Cependant, les mécanismes du recrutement de macrophages à la tumeur ne sont pas bien explorés et une meilleure compréhension des voies impliquées est cruciale pour davantage d’avancement du champ et de thérapies prometteuses. Un des défis dans l’étude des interactions entre cellules tumorales et des cellules normales dans le microenvironnement tumoral (TME) est la complexité des mécanismes et des cellules impliquées, nécessitant des approches in vitro permettant la dissection de la diaphonie. Nous présentons ici une méthodologie polyvalente qui peut être appliquée à l’étude de l’effet paracrine d’un cancer en culture cellulaire, la protéine sécrétée sur la migration des autres types de cellules comme les macrophages, in vitro. En utilisant un système où l’expression de la shARN contre une protéine de culture cellulaire du cancer impliquée dans le recrutement des monocytes est sous le contrôle du promoteur inductible tétracycline, l’effet paracrine de la protéine sécrétée sur des monocytes est quantifié. Dans ce protocole, clonage des séquences de shARN dans la tétracycline réglementée vecteur est présenté suivie de génération de lignées cellulaires cancéreuses stable. En outre, la purification des monocytes humains primaires et un dosage de chambre de Boyden servent à analyser l’effet paracrine d’une protéine dérivée de cellules cancéreuses sur la migration des monocytes.
Diminution de l’expression des gènes de codage de protéine est couramment appliquée par des techniques siRNA et shARN, mais non sans restrictions dans son utilisation. La précipitation à long terme (KD) des gènes peut-être déclencher des réactions adaptatives secondaires de cellules qui interfèrent avec les résultats expérimentaux. Absence de contrôle temporel sur l’expression génique rend difficile d’étudier le rôle dynamique d’une protéine avec le temps ou le rôle d’une protéine cruciale pour la survie des cellules. Cette question est particulièrement importante dans in vivo des paramètres, où le rôle d’une protéine dans le développement de tumeurs et la progression peut nécessiter une diminution de l’expression de la protéine d’intérêt seulement après que tumeur est établie. KD conditionnel présente l’avantage d’éviter un effet létal trop tôt de la KD sur les cellules et pour permettre l’analyse du rôle de la protéine dans les différentes étapes de la croissance de la tumeur, tandis que KD inconditionnelle pourrait entraîner en l’absence de développement de la tumeur.
Un certain nombre de systèmes de KD conditionnels ont été développé pour traiter les restrictions de KD stable. Les systèmes d’expression de gène conditionnelle incluent inductibles par l’Ecdysone surexpression systèmes, le Cytochrome P-450 induction système1, et tétracycline régulé systèmes d’expression de gène. Les systèmes d’expression génique réglé par la tétracycline permettent un contrôle sur l’expression de la shARN lors de l’addition de l’antibiotique tétracycline (ou son analogue plus stable – doxycycline). Dans les systèmes de Tet-ON, l’expression des shARN est induite en présence de tétracycline/doxycycline, résultant en une expression de gène KD, tandis que dans les systèmes de Tet-OFF, l’expression de shARN est supprimée en présence de tétracycline, ayant pour résultat l’expression des gènes. Un inconvénient du système inductible par la tétracycline est rapportés précédemment à faibles niveaux d’expression des shARN en l’absence de doxycycline – perméabilité dite6,7. Dans le Tet-ON système décrit ici, par voie de tétracycline, la liaison de la protéine de répresseur (Tite) tétracycline constitutivement exprimé à la séquence d’éléments (TRE) Tet-sensible dans le H1 est de la région promotrice de la shARN d’intérêt supprimée. Cela se traduit par l’expression de shARN et inhibition de la traduction de la protéine d’intérêt dans une façon dépendante de la tétracycline8,9.
Autres systèmes de Tet-ON disponibles incluent simultanée knock-in de la TetO séquence entre boîte TATA et élément de séquence proximale (PSE) et entre la transcription et de la boîte TATA start site développé par Chan et al.. 10 ce système nécessite moins de doses toxiques de tétracycline pour réguler l’expression de shARN, toutefois, soumis à l’état non induite, de faibles niveaux de shARN sont exprimés. La boîte Krüppel-associés (KRAB) fondé Tet-ON système11 comprend KRAB, une protéine de doigt de zinc, qui sujets gènes situés dans un rayon de 3 Ko de l’accepteur KRAB à répression transcriptionnelle. La protéine chimère tTRKRAB pouvez lier à TetO, et en raison de la large-gamme de capacité contrôlable de l’ADN, TetO ne doivent être limité entre la transcription démarrer le site et le promoteur et ont faible impact sur l’activité du promoteur. En vertu de l’état non induite, ce système de brouillage de RNA contrôlable a été signalé à montrer un niveau inférieur d’expression fuite de shARN11,12; Cependant, elle nécessite une approche séquentielle, deux vecteurs de clonage. Par rapport aux systèmes KD développés antérieurement conditionnelles comme l’Ecdysone inductibles par système de surexpression ou système d’induction du Cytochrome P-450, le système réglé par la tétracycline a l’avantage de sa robustesse et de la réversibilité et par conséquent est les plus couramment utilisés système13. Le système utilisé dans le présent protocole a l’avantage sur la TetO knock-in bicourant et système KRAB Tet-ON que requiere clonage avant droite, seul vecteur, ce qui permet la génération rapide de plusieurs clones, et il présente des niveaux très bas de perméabilité dans le absence de doxycycline.
TME est essentiel pour le développement du cancer. Pour faciliter la croissance de la tumeur, les cellules cancéreuses recrutent des monocytes inflammatoires en sécrétant des protéines chimiotactiques. Monocytes recrutés s’infiltrer dans la tumeur et se différencient en pro-tumorigènes TAMs qui contribuent à la croissance des tumeurs et des métastases. Des études in vitro du recrutement des cellules immunitaires utilisent les tests de migration, avec Boyden, test de chambre étant largement utilisé14,15,16,17. Dans ce test, la source de protéine facteur chimiotactique, par exemple, les cellules cancéreuses, ou une protéine purifiée, est placée dans le bas du réservoir. Les cellules immunitaires sont placés dans la chambre haute, séparée par une membrane poreuse du compartiment inférieur. Migrer vers la pente croissante du facteur chimiotactique et ceux que l’on trouve sur la face inférieure de la membrane des cellules sont colorées et comptés sous le microscope. Ici, nous testons la fonction de facteur chimiotactique des PAI 1 (PAI-1) sur les monocytes en générant des lignées cellulaires de cancer stable, inductible où expression de PAI-1 est régulée par l’addition de la doxycycline. Nous utilisons des monocytes humains primaires dans le test de migration de chambre de Boyden pour évaluer le rôle de PAI-1 dans la migration des monocytes. Différences entre des monocytes humains primaires et lignées monocytaire largement utilisé comme THP1 ont été signalés et incluent l’expression de différentes cytokines modèles18; par exemple, 5 à 10 fois plus dans les niveaux d’expression de TNF-α par les cellules THP1 par rapport aux monocytes humains19. Les cellules THP1 proviennent des cellules de la leucémie humaine monocytaire, sont faciles à entretenir et se multiplient avec une moyenne de temps de 50-19 h20. Au contraire, les monocytes humains sont caractérisés par une durée de vie courte en l’absence de facteurs de croissance. Étant donné que les monocytes sont purifiées à partir de sang de donneurs, une bonne quantité de variabilité se produit entre les individus et selon la méthode de purification, contamination avec les autres types de cellules peut se produire. Néanmoins, monocytes primaires sont pertinentes et il a été recommandé d’utiliser ou de confirmer les résultats obtenus avec les lignées monocytaire utilisant des monocytes primaires dans la recherche biologique,19. Nous décrivons ici un protocole pour la purification des humains primaires monocytes du sang périphérique. Autres méthodes de purification de monocyte incluent les protocoles adhésion et gradient de densité et de la procédure en deux étapes avec seul gradient de Ficoll-Hypaque suivie d’un gradient de Percoll21. La pureté de la population de monocyte obtenue par ces gammes de méthodes entre 70 et 90 %. La méthode décrite ici utilise un gradient de densité, suivi d’une sélection immunitaire négative22 et permet la purification des monocytes humains sans contact direct avec des anticorps, ainsi pour éviter leur activation accidentelle et résultant en un > 95 % population pure des monocytes.
Le protocole présenté ici est utilisé pour la mise en place d’un système fonctionnel de Tet-ON pour l’expression des gènes KD en lignées cellulaires cancéreuses humaines pour étudier l’effet chimiotactique de la protéine sécrétée dérivé du cancer PAI-1 sur les monocytes. PAI-1 est surexprimé par une variété de tumeurs et de son expression paradoxalement en corrélation avec des résultats cliniques pauvres23,24. Le rôle de pro-tumorigène de PAI-1 est le résultat de ses pro-angiogénique et anti-apoptotique fonctions25,26. PAI-1 s’est avéré contribuent à l’inflammation en favorisant le recrutement de macrophages sur le site de l’inflammation,27. PAI-1 a été montré pour promouvoir le muscle lisse cellmigration28,29 et de participer à la Mac-1 charge macrophage migration30. Surexpression de PAI-1 a été également démontrée à améliorer considérablement le recrutement de macrophages Raw 264.7 dans B16F10 mélanome tumeurs31. Cependant, le rôle de PAI-1 dans la migration de TAM n’a pas été étudié en détail. Le protocole décrit nous permet de répondre à la question de savoir si PAI-1 attire les monocytes, cellules cancéreuses. Cette méthodologie permettant une dissection de la diaphonie entre la tumeur et TME en faisant taire la protéine sécrétée dans les cellules cancéreuses et en analysant les composants de la TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
Composé d’une variété de types de cellules, le TME est crucial pour le développement du cancer. Afin de déterminer les conditions optimales de croissance, les cellules cancéreuses attirent les monocytes par sécrétion de facteurs chimiotactiques. Nous présentons ici un protocole pour l’étude du mécanisme de recrutement de monocytes par des cellules tumorales in vitro. À cette fin, une combinaison de système d’expression de gène inductible, purification des monocytes humains primaires et à tit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Jacqueline Rosenberg pour la relecture du manuscrit. Ce travail a été soutenu par le US Department of Health and Human Services/National Institutes of Health grâce à une subvention à YA DeClerck (Don 5R01 CA 129377) et la Fondation de Martell TJ. MH Kubala est le récipiendaire d’une bourse de développement de carrière de chercheur de l’Institut de recherche de Saban à la Hospital de Los Angeles de l’enfance.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
