الشرطي ضربة قاضية للتعبير الجيني في خطوط خلايا السرطان لدراسة توظيف حيدات/الضامة إلى ورم المكروية
Summary
هذا البروتوكول يعمل كمخطط لإقامة نظام على تيت وظيفية في خطوط خلايا السرطان واستخدامها لاحقاً، لا سيما لدراسة دور البروتينات المشتقة من خلية الورم في تجنيد حيدات/الضامة إلى ورم المكروية.
Abstract
siRNA وهدم شرنا بوساطة أساليب (دينار كويتي) لتنظيم التعبير الجيني أدوات لا تقدر بثمن لفهم وظيفة الجينات والبروتين. ومع ذلك، في هذه القضية أن دينار كويتي بروتين الفائدة له تأثير مميتة على الخلايا أو الأثر المتوقع دينار كويتي تعتمد على الوقت، دون قيد أو شرط وأساليب دينار كويتي غير مناسبة. نظم الشرطي هي أكثر ملاءمة في هذه الحالات، وقد خضعت للكثير من الاهتمام. وتشمل هذه النظم overexpression Ecdysone إيندوسيبلي، P-450 الفسفرة التعريفي نظام1، والتتراسيكلين وتنظم أنظمة تعبير الجينات.
يتيح نظام التعبير الجيني التتراسيكلين وينظم عكسها السيطرة على التعبير البروتين بالاستقراء تعبير شرنا حضور التتراسيكلين. في هذا البروتوكول، نقدم تصميم تجريبي استخدام وظيفية تيت-على نظام في خطوط خلايا السرطان البشرية للشرطي تنظيم التعبير الجيني. ثم نظهر استخدام هذا النظام في دراسة التفاعل الوحيدات الخلية الورم.
Introduction
ورم المرتبطة الضامة (تامس) الإسهام في التنمية الورم بتشجيع نمو الورم، وورم خبيث، وتنظيم الاستجابة المناعية2. سرطان خلايا وحيدات المجند التحريضية، التي اختراق الورم وتفرق في برو الورمية تامس3. تسلل للورم مع تامس يرتبط بضعف النتائج السريرية وقد ارتبط بدور كآبته الضامة4،5. ومع ذلك، لم يتم استكشاف آليات توظيف الضامة للورم جيدا وفهم أفضل للمسارات المعنية أمر حاسم لمزيد النهوض بالميدان والعلاجات الواعدة. أحد التحديات في دراسة التفاعلات بين الخلايا السرطانية والخلايا الطبيعية في ورم المكروية (TME) هو تعقد الآليات والخلايا المعنية، التي تتطلب نهجاً في المختبر أن السماح بتشريح للحديث المتبادل. نقدم هنا منهجية تنوعاً التي يمكن تطبيقها على دراسة تأثير باراكريني من السرطان المستمدة من الخلايا يفرز البروتين على هجرة أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة، في المختبر. باستخدام نظام حيث يتم التعبير عن شرنا ضد بروتين المستمدة من خلايا سرطان المتورطين في تجنيد وحيدات تحت سيطرة المروج التتراسيكلين إيندوسيبلي، هو كوانتيتاتيد paracrine تأثير البروتين يفرز على وحيدات. في هذا البروتوكول، استنساخ تسلسلات شرنا إلى التتراسيكلين يرد ناقل التنظيم متبوعاً بجيل خطوط خلايا السرطان مستقرة. علاوة على ذلك، تستخدم تنقية وحيدات البشرية الأساسية ومقايسة دائرة Boyden لتحليل أثر paracrine بروتين الخلايا السرطانية المستمدة على هجرة وحيدات.
عادة يتم تطبيق Downregulation البروتين ترميز الجينات مع تقنيات siRNA وشرنا، على الرغم من أن ليس من دون قيود على استخدامها. الطويلة الأجل تدق لأسفل (دينار كويتي) من الجينات قد تثير الاستجابات التكيفية الثانوية للخلايا التي تتداخل مع النتائج التجريبية. عدم سيطرة مؤقتة على التعبير الجيني يجعل من التحدي لدراسة الدور الدينامي للبروتين على مر الزمن أو دور حاسم لبقاء الخلية البروتين. هذا الموضوع يكتسي أهمية خاصة في الإعدادات في فيفو ، حيث قد يتطلب دور البروتين في ورم في التنمية والتقدم downregulation التعبير عن بروتين الفائدة إلا بعد أن ينشأ الورم. ويمتاز شرطي كويتي لمنع تأثير فتاكة مبكر جداً دينار كويتي في الخلايا، وتمكين تحليل دور البروتين في مراحل مختلفة من نمو الورم، بينما دينار كويتي غير المشروط يمكن أن تؤدي إلى نقص التنمية الورم.
قد وضعت عددا من شرطي كويتي نظم لمعالجة القيود المفروضة على دينار مستقرة. تشمل أنظمة تعبير الجينات المشروط اكديسوني إيندوسيبلي overexpression النظم، نظام P-450 الفسفرة التعريفي1، وينظم التتراسيكلين أنظمة تعبير الجينات. تسمح أنظمة تعبير الجينات تنظم التتراسيكلين السيطرة على التعبير عن شرنا عند إضافة التتراسيكلين مضاد حيوي (أو التماثلية أكثر استقرارا-الدوكسي). في النظم على تيت، هو فعل التعبير عن شرنا حضور التتراسيكلين/الدوكسي أسفر عن تعبير جينات دينار كويتي، بينما في التيت قبالة النظم، يتم منع التعبير عن شرنا حضور التتراسيكلين الناتجة في التعبير الجيني. عيب نظام التتراسيكلين إيندوسيبلي ذكر سابقا مستويات منخفضة من التعبير عن شرنا في غياب الدوكسي-يجتازها ما يسمى6،7. في التيت-على وصف نظام هنا، عند إدارة التتراسيكلين، ربط مؤثرا أعرب التتراسيكلين قامع (تت) البروتين إلى تسلسل العنصر (ترى) تيت المراعية داخل H1 منطقة المروج من شرنا للفائدة وقمعت. هذه النتائج في التعبير عن شرنا وتثبيط لترجمة بروتين اهتمام ب طريقة تعتمد على التتراسكلين8،9.
تشمل نظم تيت على المتاحة الأخرى المتزامنة في ضرب من تيتو التسلسل بين مربع تاتا وعنصر تسلسل الدانية (PSE) وبين مربع تاتا والنسخ البدء في تطوير الموقع بواسطة تشان وآخرون. 10 هذا النظام يتطلب أقل من جرعات سامة من التتراسيكلين لتنظيم التعبير شرنا، ولكن ضمن دولة غير التي يتسبب فيها، وتدني مستويات شرنا يتم التعبير عنها. نظام تيت على مربع المرتبطة كربل (KRAB) على أساس11 يتضمن KRAB، بروتين إصبع زنك، الجينات المواضيع الموجودة داخل نطاق 3 كيلو بايت من الموقع KRAB ملزمة لقمع النسخي. يمكن ربط تركراب البروتين تشيميريك إلى تيتو، وسبب الكبير-نطاق قدرة السيطرة عليها الحمض النووي، تيتو لا حاجة محدودة بين النسخ لبدء تشغيل الموقع والمروج وقد أثر انخفاض في نشاط المروج. في ظل حالة عدم فعل، ذكر هذا النظام تدخل الجيش الملكي النيبالي يمكن السيطرة عليها لإظهار مستوى أدنى من التعبير تسربت من شرنا11،12؛ بيد أنه يقتضي اتباع نهج استنساخ اثنين-ناقل متسلسل. بالمقارنة مع نظم دينار كويتي الشرطي سابقا المتقدمة مثل اكديسوني إيندوسيبلي أوفيريكسبريشن النظام أو النظام التعريفي P-450 الفسفرة، نظام ينظم التتراسيكلين ويمتاز المتانة وإمكانية الرجوع، وبالتالي هو وتستخدم معظم روتيني النظام13. النظام المستخدم في هذا البروتوكول له ميزة على تيتو تدق في النظام المزدوج و KRAB تيت-على نظام كما أنه يتطلب ناقل مستقيم إلى الأمام، واحد الاستنساخ، مما يتيح توليد سريعة لاستنساخ متعددة، وأنه يسلك مستويات منخفضة جداً من يجتازها في نظراً لغياب الدوكسيسيكلين.
TME حاسم بالنسبة لتطور السرطان. لتسهيل نمو الورم، تجنيد الخلايا السرطانية وحيدات الملتهبة بإفراز البروتينات تشيموتاكتيك. اختراق الورم وحيدات المعينين وتفرق في تامس برو الورمية التي تسهم في نمو الورم والانبثاث. الدراسات في المختبر لتجنيد الخلايا المناعية استعمال فحوصات الهجرة، مع Boyden غرفة الفحص يجري على نطاق واسع استخدام14،15،،من1617. في هذا الفحص، يتم وضع مصدر البروتين تشيمواتراكتانت، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية، أو بروتين المنقي، في الدائرة السفلي. وتوضع الخلايا المناعية في مجلس الشيوخ فصل مع الأغشية المسامية من حجرة السفلي. ترحيل نحو التدرج المتزايد تشيمواتراكتانت، وتلك التي عثر عليها في الجانب السفلي من الغشاء الخلايا الملون وتحسب تحت المجهر. هنا نقوم باختبار وظيفة البلاسمينوجين منشط المانع 1 (أي-1) تشيمواتراكتانت على وحيدات بتوليد خطوط خلايا السرطان مستقرة، إيندوسيبلي حيث ينظم التعبير بأي-1 إضافة الدوكسي. نحن نستخدم وحيدات الابتدائي البشرية في مقايسة الهجرة الدائرة Boyden لتقييم دور PAI-1 في الهجرة الوحيدات. الاختلافات بين وحيدات الأساسية البشرية وخطوط الخلايا مونوسيتيك المستخدمة على نطاق واسع مثل THP1 وأفيد وتشمل سيتوكين مختلف أنماط التعبير18؛ على سبيل المثال، مقارنة مع 5-10 إضعاف الزيادة في مستويات التعبير تنف-α بالخلايا THP1 وحيدات البشرية19. خلايا THP1 مشتقة من خلايا سرطان الدم البشرية مونوسيتيك، وهي سهلة للحفاظ على، وتتكاثر مع متوسط مضاعفة الوقت ح 19-5020. على العكس من ذلك، تتميز وحيدات البشرية بعمر قصير وفي غياب عوامل النمو. منذ وحيدات يتم تنقيته من الدم من الجهات المانحة، ويحدث قدرا كبيرا من التباين بين الأفراد، واعتماداً على طريقة تنقية، قد يحدث التلوث بأنواع الخلايا الأخرى. ومع ذلك، وحيدات الأساسية ذات الصلة وقد أوصى باستخدام أو تأكيد النتائج التي تم الحصول عليها مع خطوط الخلية مونوسيتيك استخدام وحيدات الأولية في البحوث البيولوجية19. هنا يصف لنا بروتوكول لتطهير البشرية وحيدات الأولية من الدم المحيطي. وتشمل أساليب بديلة لتنقية الوحيدات الكثافة المتدرجة والالتصاق البروتوكولات وإجراء الخطوة اثنين مع التدرجات واحدة من فيكل-هيباك، متبوعاً تدرج بركل21. نقاء السكان الوحيدات التي حصلت عليها تلك الأساليب يتراوح بين 70-90 في المائة. الأسلوب الموصوفة هنا يستخدم تدرج كثافة متبوعاً تحديد المناعي سلبي22 ويتيح تنقية وحيدات البشرية دون الاتصال المباشر مع الأجسام المضادة، وبالتالي تجنب بهم التنشيط العرضي وأسفر عن > السكان نقية 95% من وحيدات.
يتم استخدام البروتوكول المعروضة هنا لإقامة نظام على تيت وظيفية للتعبير الجيني دينار كويتي في خطوط خلايا السرطان البشرية لدراسة تأثير chemoattractant المستمدة من سرطان يفرز البروتين بأي-1 على وحيدات. PAI-1 هو أوفيريكسبريسيد بمجموعة متنوعة من الأورام، والتعبير عن المفارقة ترتبط بضعف النتائج السريرية23،24. دور المحترفين ورمي بأي-1 نتيجة لما برو-الأوعية ومهام مكافحة أبوبتوتيك25،26. قد ثبت بأي-1 المساهمة في التهاب بتشجيع توظيف الضامة للموقع لالتهاب27. وأبدى بأي-1 تعزيز العضلات الملساء سيلميجريشن28،29 والمشاركة في الهجرة تعتمد بلعم ماك-130. Overexpression PAI-1 أظهرت أيضا تعزز كثيرا من تجنيد الضامة 264.7 الخام في أورام سرطان الجلد B16F1031. ومع ذلك، لم يتم التحقيق دور PAI-1 في الهجرة تام بالتفصيل. نحن نستخدم بروتوكول وصف للإجابة على سؤال ما إذا كان يجذب الباي-1 وحيدات للخلايا السرطانية. يسمح هذه المنهجية تشريح الحديث المتبادل بين الورم و TME إسكات يفرز البروتين في الخلايا السرطانية وتحليل مكونات TME.
Protocol
Representative Results
Discussion
تتألف من مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا، TME حاسمة بالنسبة لتطور السرطان. للتأكد من ظروف النمو المثلى، جذب الخلايا السرطانية وحيدات عن طريق إفراز عوامل تشيموتاكتيك. نقدم هنا بروتوكولا لدراسة إليه تجنيد الوحيدات بورم الخلايا في المختبر. لهذا الغرض، يتم استخدام مزيج من الجينات إيندوسي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب تود أن تقر روزنبرغ جاكلين لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط. كان يؤيد هذا العمل لنا وزارة الصحة والخدمات الإنسانية والوطنية معاهد الصحة مع منحة يا ديكليرك (منح 5R01 كاليفورنيا 129377) ومؤسسة مارتل “تي جي”. كوبالا MH هو المستفيد من منحة “زمالة بحث الوظيفية التنمية” معهد سابان للبحث في “مستشفى لوس أنجليس” في الأطفال.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
References
- Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
- Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
- Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
- Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
- Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
- Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
- Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
- Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
- Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
- Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
- Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
- Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
- Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
- Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
- Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
- Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
- de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
- Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
- Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
- Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
- Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
- Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
- Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
- Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
- Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
- Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
- Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
- Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
- Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
- Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
- Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).
