암 세포 선 종양 Microenvironment에 Monocytes/대 식 세포의 모집 연구에서 유전자 발현의 조건부 최저
Summary
이 프로토콜 공부 monocytes/세포 종양 microenvironment에의 채용에 있는 종양 세포 유래 단백질의 역할에 대 한 특히 암 세포 선 및 그것의 사용, 기능 Tet에 시스템 설정에 대 한 방식으로 제공 합니다.
Abstract
siRNA 및 유전자 발현 조절의 (KD) 방법 아래로 노크 shRNA 중재 유전자와 단백질의 기능을 이해 하기 위한 귀중 한 도구가 있습니다. 그러나,이 관심사의 단백질의 KD 세포에 치명적인 효과가 나는 KD의 기대 효과 경우에서 시간 종속, 무조건 KD 방법 적절 한 하지 않습니다. 조건부 시스템은 이러한 경우에 더 적합 하 고 많은 관심의 대상이 되고있다. 이러한 Ecdysone 유도할 수 있는 overexpression 시스템, 시 토 크롬 P-450 유도 시스템1를 포함 하 고 있는 항생물질 규제 유전자 식 시스템.
항생물질 통제 유전자 식 시스템 항생물질 존재 shRNA 식의 유도 의해 단백질 표정 가역 제어할을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 유전자 발현의 조건부 규칙에 대 한 인간 암 세포 라인에 기능 Tet에 시스템을 사용 하 여 실험 설계를 제시. 우리는 다음 종양 세포 monocyte 상호 작용의 연구에서이 시스템의 사용을 보여 줍니다.
Introduction
홍보 함으로써 종양 개발에 기여 하는 관련 된 종양 세포 (Tam) 종양의 성장, 전이, 그리고 면역 반응2를 조절. 암 세포 모집 염증 monocytes, 종양 침투 하 고 프로 tumorigenic Tam3으로 차별화. Tam와 종양의 침투 빈약한 임상 결과와 상관 관계가 고 대 식 세포4,5의 면역 역할에 연결 되었습니다. 그러나, 대 식 세포는 종양의 채용의 메커니즘은 잘 탐험 하지 고 참여 통로의 더 나은 이해 하는 것은 더 유망한 요법 분야의 발전을 위한 중요 한. 종양 세포와 정상 세포에서 종양 microenvironment (TME) 간의 상호 작용을 공부 하 고 있는 과제 중 하나입니다 메커니즘 및 셀 요구는 크로스 토크의 해 부를 허용 하는 체 외에서 접근, 참여의 복잡성. 여기 우리는 암 세포 유래의 paracrine 효과, 대 식 세포, 생체 외에서처럼 다른 세포 유형의 마이그레이션에 분 비 단백질 연구에 적용할 수 있는 다양 한 방법론을 제시. ShRNA는 암 세포 유래 단백질에에서 관여 monocytes의 채용에 대 한의 식을 항생물질 유도할 수 있는 발기인의 통제는 시스템에 사용 하 여, monocytes에 secreted 단백질의 paracrine 효과 quantitated 이다. 이 프로토콜, 안정 암 세포 라인의 세대 뒤 규제 벡터 제시 항생물질 shRNA 시퀀스의 복제. 또한, 기본 인간 monocytes 그리고 Boyden 챔버 분석 결과의 정화는 monocytes의 마이그레이션에는 암 세포 파생 된 단백질의 paracrine 효과 분석 하는 데 사용 됩니다.
단백질 코딩 유전자의 Downregulation 일반적으로 비록 그것의 사용에 제한 없이 siRNA와 shRNA 기술로 적용 됩니다. 유전자의 장기 노크 다운 (KD) 실험 결과 방해 하는 셀의 보조 적응 반응 유도 수 있습니다. 일시적인 유전자 발현 제어의 부족 하면 시간 또는 세포 생존을 위해 중요 한 단백질의 역할은 단백질의 동적 역할을 연구 하는 도전 수 있습니다. 이 문제는 설정 비보에 ,에서 특히 중요 한 종양 개발 및 진행에 단백질의 역할이 종양 설립 후에 관심사의 단백질의 표현의 downregulation를 필요할 수 있습니다. 조건부 KD 방지는 너무 치명적인 효과 KD의 셀에 고 무조건 KD 종양 개발의 부족 귀 착될 수 있었다 하는 동안 종양 성장의 다른 단계에서 단백질의 역할의 분석을 가능 하의 이점이 있다.
다양 한 조건부 KD 시스템 안정적인 KD의 한계를 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 조건부 유전자 표정 시스템 포함 Ecdysone 유도할 수 있는 overexpression 시스템, 시 토 크롬 P-450 유도 시스템1, 그리고 항생물질 규제 유전자 식 시스템. 항생물질 통제 유전자 표정 시스템 항생제 항생물질 (또는 그것의 보다 안정적인 아날로그-doxycycline)의 추가 따라 shRNA의 표현 제어할을 수 있습니다. Tet-켜 짐 시스템 shRNA 표현의 항생물질/doxycycline KD, 유전자 발현의 결과로 존재 유도 된다 Tet 오프 시스템에 shRNA 표현의 항생물질 인 유전자 발현의 억제. 항생물질을 유도할 수 있는 시스템의 결점은 이전에 보고 된 저급 shRNA doxycycline-소위 시키는6,7의 부재에서의 표현의. Tet에 시스템 여기에 설명 된, 항생물질의 관리에 따라 관심의 shRNA의 발기인 영역이 H1 내 Tet 응답 요소 (TRE) 시퀀스에 constitutively 표현된 항생물질 진압 (TetR) 단백질 바인딩 표시 되지 않습니다. ShRNA 표현과 저해 항생물질 종속 방식으로8,9에 관심사의 단백질의 번역의 결과.
다른 사용 가능한 Tet-켜 짐 시스템 포함 동시 노크-TetO 시퀀스 및 TATA 상자와 전사 TATA 상자 및 인접 시퀀스 요소 (PSE) 사이의 시작 찬 외에 의해 개발 된 사이트의. 그러나 10 이 시스템 shRNA 식,, 비 유도 된 상태에서 규제 하는 항생물질의 유독한 복용량의 낮은 수준 shRNA 보다 적게 표현 됩니다 필요 합니다. Krüppel 관련 상자 (리아) 기반 Tet-켜 짐 시스템11 리아를, 과목 유전자 transcriptional 억제 하 리아 바인딩 사이트의 3 kb 범위 내에 있는 아연 손가락 단백질을 포함 한다. 공상 단백질 tTRKRAB TetO, 바인딩할 수 및 큰-DNA 제어 용량 범위, 때문 TetO 할 하지 필요 전사 사이 제한 시작 사이트 및 발기인 고 낮은 충격 발기인의 활동에. 유발 되지 않은 상태에서이 제어 RNA 간섭 시스템 shRNA11,12;의 유출 된 식의 하위 수준 표시를 보고 되었다 그러나, 그것은 연속, 2-벡터 복제 접근을 필요로 한다. 이전 개발된 조건부 KD 시스템 overexpression 시스템 Ecdysone 유도할 수 있는 등 시 토 크롬 P-450 유도 시스템에 비해 항생물질 규제 시스템의 견고성 및 가역, 장점이 이며 따라서 가장은 일상적으로 시스템13사용. 이 프로토콜에 사용 되는 시스템은 듀얼 TetO 노크에서 시스템 및 리아 Tet-켜 짐 시스템의 이점을 정직, 단일 벡터 클로닝, 여러 클론의 빠른 생성을 허용을 요구 하 고 그것은 전시에 시키는의 매우 낮은 수준으로는 doxycycline의 부재입니다.
TME 암 개발에 대 한 중요 하다입니다. 종양의 성장을 촉진 하기 위하여 암 세포 염증 monocytes 혈 단백질을 은닉 하 여 모집 합니다. 모집된 monocytes 종양 침투 하 고 종양 성장 및 전이에 기여 하는 프로 tumorigenic Tam으로 차별화 합니다. 면역 세포 신규 모집의 생체 외에서 연구 활용 마이그레이션 분석 실험, Boyden 챔버 시험 되 고 널리 사용14,15,,1617. 이 분석 결과에서 chemoattractant 단백질 소스, 예를 들어 암 세포, 또는 순화 된 단백질은 아래쪽 챔버에 배치 됩니다. 면역 세포는 아래쪽 구획에서 다공성 막으로 분리 된 상단 챔버에 배치 됩니다. 셀의 chemoattractant, 그리고 그는 막의 더 낮은 측에 발견 증가 그라데이션으로 마이그레이션 스테인드 고 현미경 계산. 여기 우리가 테스트 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 1 (파이-1)의 chemoattractant 함수에 monocytes 파이-1의 표현 doxycycline 추가 의해 통제 된다 안정, 유도할 수 있는 암 세포 라인을 생성 하 여. 우리는 monocyte 마이그레이션에서 파이-1의 역할을 평가 하기 위해 Boyden 챔버 마이그레이션 분석 결과에서 인간의 기본 monocytes를 사용 합니다. 인간의 기본 monocytes 그리고 THP1 같은 널리 사용 되는 monocytic 셀 라인의 차이점 보고 되었습니다 및 다른 cytokine 표현 패턴18; 포함 예를 들어 THP1 세포에서 TNF-α 식 수준에 5-10 배 증가 인간 monocytes19에 비해. THP1 셀 인간의 백혈병 monocytic 세포에서 파생 됩니다, 그리고 쉽게 유지, 평균 19-50 h20의 시간을 두 배로 증식 하는. 그와 반대로, 인간 monocytes 성장 요인의 부재에는 짧은 수명이 특징입니다. Monocytes는 가변성의 상당량 발생는 개인 중 고 정화 방법에 따라 기증자의 혈액에서 정화 이후 다른 세포 유형으로 오염 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 기본 monocytes 관련 되며 기본 monocytes를 사용 하 여 생물학 연구19에서 monocytic 셀 라인으로 얻은 결과 확인 또는 사용 권장 되었습니다. 여기는 말 초 혈액에서 인간의 기본 monocytes의 정화에 대 한 프로토콜에 설명합니다. Monocyte 정화의 다른 방법 밀도 그라데이션 및 접착 프로토콜 및 단일 그라디언트 Ficoll-Hypaque Percoll 그라데이션21다음의 2 단계 절차를 포함 됩니다. 70-90% 사이 그 방법 범위에 의해 얻은 monocyte 인구의 순도. 여기 설명 하는 방법을 뒤에는 부정적인 면역 선택22 밀도 그라디언트를 사용 하 여 및 수 있습니다 항 체와 직접 접촉 하지 않고 인간 monocytes의 정화 함으로써 그들의 우발적인 활성화를 방지 하 고 발생 하는 > monocytes의 95% 순수 인구입니다.
여기에 제시 된 프로토콜 암 파생 secreted 단백질의 파이 1 monocytes에 chemoattractant 효과 연구를 유전자 발현 KD 인간 암 세포 라인에 대 한 기능 Tet에 시스템 설정에 사용 됩니다. 파이-1 다양 한 종양에 의해 overexpressed와 식을 역설적으로 가난한 임상 결과23,24상관. 파이-1의 프로 tumorigenic 역할의 프로-신생의 결과 이며, 안티-apoptotic 기능25,26. 파이-1 세포 염증27의 사이트에 모집을 홍보 하 여 염증에 기여할 표시 되었습니다. 파이-1 부드러운 근육 cellmigration,2829 를 조성 하 고 맥 1 종속 macrophage 마이그레이션30에 참여를 표시 했다. 파이 1 overexpression 또한 크게 B16F10 흑색 종 종양31에 Raw 264.7 세포의 모집을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그러나, TAM 마이그레이션에서 파이-1의 역할 자세히 조사 하지는. 우리는 파이-1 암 세포에 monocytes를 유치 하는 여부의 질문에 대답을 설명 된 프로토콜을 사용 합니다. 이 방법론 암 세포에서 secreted 단백질을 침묵 하 고는 TME의 구성 요소를 분석 하 여 종양과 TME 사이 누화의 해 부를 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
다양 한 종류의 세포로 구성은 TME 암 개발에 대 한 결정적 이다. 최적의 성장 조건 확인, 암 세포는 monocytes 혈 요인의 분 비를 통해 유치. 여기 선물이 종양 세포에서 생체 외에서의해 monocyte 모집의 메커니즘을 공부에 대 한 프로토콜. 이 위해 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템, 기본 인간 monocytes 그리고 마이그레이션 분석 결과, Boyden 챔버 분석 결과의 예를 들어 정화의 조합이 사용 됩니다…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 원고를 교정에 대 한 재클린 로젠버그를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 부의 보건 및 인적 서비스/국립 보건원 DeClerck에 부여와에 의해 지원 되었다 (5R01 CA 129377 부여)와 TJ 마르텔 재단. MH Kubala의 Saban 연구소 어린이 병원의 로스 앤젤레스에서 연구 경력 개발 장학금 상 받는 사람입니다.
Materials
| Tet-pLKO-puro lentiviral vector | Addgene | 21915 | |
| FBS (Tetracycline-free) | Omega Scientific | FB-15 | |
| Histopaque | Sigma | 10771-500ML | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | StemCell | 19059 | |
| EasySep Magnet | StemCell | 18002 | |
| EcoRI HF | NEB | R3101S | |
| AgeI HF | NEB | R3552S | |
| Cut Smart buffer | NEB | B7200S | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup System | PROMEGA | A9281 | |
| psPAX vector | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G vector | Addgene | 12259 | |
| One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coli | Thermo Fisher Scientific | C737303 | |
| Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stain | Protocol | 123-869 | |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-1573 | |
| PBS | Corning | 21-031-CV | |
| XhoI restriction enzyme | NEB | R0146S | |
| Ligase | NEB | M0202S | |
| Ligase buffer | NEB | M0202S | |
| EDTA 0.5 M solution | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| The Big Easy" EasySep Magnet | Stem Cell | 18001 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| Sodium butyrate | Sigma-Aldrich | B5887 | |
| 0.45 μM syringe filters | VWR International | 28145-479 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-500g | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Invitrogen | 15504-020 | |
| Sodium Chloride(NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653-5 kg | |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| dithioerythritol (DTE) | Sigma-Aldrich | B8255-5g | |
| ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 792780 | |
| tryptone | Amresco | J859-500g | |
| yeast extract | Fluka | 70161-500g | |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| ampicillin | Sigma-Aldrich | A9393-5g | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| phosphate-buffered saline (PBS) | Corning | 21-031-CV | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| puromycin | Sigma-Aldrich | P9620 | |
| Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891-25g | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) | Corning | 10-040-CV | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | R1021 | |
| Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET Membrane | Becton Dickinson | 353097 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cotton-Tipped Applicator | Medline | MDS202000 | |
| Protocol Hema 3 STAT pack | Fisher Scientific Company | 123-869 | |
| Resolve Immersion Oil, High Viscosity | Richard Allan Scientific | M4004 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 |
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