Inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores de las subpoblaciones de células T en muestras de carcinoma de células escamosas humanas orofaríngeas fijadas con formol fijadas en parafina
Summary
La inmunohistoquímica de fluorescencia multiparamétrica puede usarse para evaluar el número, la distribución relativa y la localización de las poblaciones de células inmunes en el microambiente tumoral. Este manuscrito describe el uso de esta técnica para analizar las subpoblaciones de células T en el cáncer orofaríngeo.
Abstract
La técnica de inmunohistoquímica de fluorescencia de cuatro colores (IHC) es un método para cuantificar las poblaciones de células de interés, teniendo en cuenta su distribución relativa y su localización en el tejido. Esta técnica ha sido ampliamente aplicada para estudiar el infiltrado inmune en diversos tipos de tumores. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunitarias que son atraídas hacia el sitio del tumor. Se ha descubierto que diferentes poblaciones de células inmunes juegan diferentes papeles en el microambiente tumoral y tienen un impacto diferente en el resultado de la enfermedad. Este manuscrito describe el uso de la fluorescencia multiparamétrica IHC en carcinoma de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) como ejemplo. Esta técnica puede extenderse a otras muestras de tejidos y tipos de células de interés. En el estudio presentado, se analizó el compartimento intraepitelial y estromal de una cohorte OPSCC grande (n = 162). Nos centramos en los linfocitos T totales (CD3 + ), inmunodepresores(TREGs, es decir, FoxP3 + ), y células T auxiliar 17 (Th17) ( es decir, IL-17 + CD3 + ) utilizando un contraste nuclear para distinguir el epitelio tumoral del estroma. Se encontró que un alto número de células T estaba correlacionado con una supervivencia libre de enfermedad mejorada en pacientes con un número bajo de células IL-17 + no-T intratumoral. Esto sugiere que las células no-T de IL-17 + pueden estar correlacionadas con una respuesta inmune pobre en OPSCC, lo que está de acuerdo con la correlación descrita entre IL-17 y la mala supervivencia en pacientes con cáncer. Actualmente, se están desarrollando nuevas técnicas de IHC de fluorescencia multiparámetro que utilizan hasta 7 fluorocromos diferentes y permitirán la caracterización y localización más precisas de las células inmunitarias en el microambiente tumoral.
Introduction
Los carcinomas de células escamosas orofaríngeas (OPSCC) son un grupo heterogéneo de cánceres de células escamosas que se originan en la orofaringe. Los factores de riesgo para OPSCC incluyen la infección por el virus del papiloma humano (VPH) y el consumo de alcohol y tabaco 1 , 2 . El papel de la respuesta inmune y cómo usar esto en un entorno clínico está empezando a ser explorado. El microambiente tumoral está infiltrado por las células inmunes que son atraídas al sitio del cáncer. Aunque una alta frecuencia de células T citotóxicas CD8 + se ha correlacionado con la supervivencia mejorada en pacientes OPSCC 3 , el papel de otros subconjuntos de células T, incluyendo Tregs y células Th17, todavía no está claro 4 . Mientras que las células Th1 y Th17 se supone para ayudar en la respuesta inmune dirigida a las células tumorales, Tregs son bien conocidos por sus capacidades para suprimir la actividad de otras células T [ 5] . Sin embargo, la presencia de TRegs ha demostrado que se correlaciona con respuestas favorables y desfavorables en diferentes tipos de tumores [ 6] . Dado que no todas las células inmunitarias presentes en la sangre se infiltran en el tumor en la misma medida, el estudio del microambiente local del tumor proporciona la medida más fiable de la respuesta inmune dirigida contra el tumor. El objetivo de este estudio es determinar la correlación entre los números y tipos de células inmunes y el resultado clínico. Se utilizó cuatro colores de fluorescencia IHC de imágenes para analizar el número y la localización de varias subpoblaciones de células T en humanos OPSCC.
Nos centramos en el total de linfocitos T (CD3 + ), Th17 células, y inmunosupresores FoxP3 + Tregs, cuya diferenciación vía está estrechamente relacionado con Th17 células. Las células Th17 se caracterizan por la combinación de CD3 e IL-17. La citocina IL-17 también puede ser producida por células no T 7 . Se determinó la distribución de intra-epitCélulas T heliales y estromales, Tregs, Th17, e IL-17 + células no T en una gran serie de casos OPSCC y analizaron las correlaciones con la supervivencia del paciente. Se usó fluorescencia multicolor IHC para identificar la expresión de CD3, Foxp3 e IL-17, en combinación con un contraste de DAPI. Este ensayo permitió la identificación fácil y clara de ambas células tumorales (usando tinción nuclear DAPI) y las poblaciones de células T infiltrantes (usando una combinación de diferentes marcadores). Después de la preparación de la muestra y la tinción, un microscopio fluorescente y software de imágenes se utilizaron para separar los diferentes colores fluorescentes utilizados y para determinar el número y el tipo de células presentes tanto en el epitelio tumoral y el estroma asociado al tumor.
Un análisis alternativo para cuantificar y fenotipo de poblaciones de células inmunitarias es el análisis de citometría de flujo, o análisis de citometría por tiempo de vuelo (CyTOF), de muestras tumorales o periféricas ( es decir, sangre o ascitis). Usando esto, Se pierde toda la información sobre localización y distribución relativa de los diferentes tipos de células. El uso y análisis de muestras periféricas tampoco proporciona información sobre qué células son capaces de infiltrarse en el microambiente tumoral. Los análisis de sangre y ascitis de células inmunes se han demostrado no para reflejar el fenotipo y la frecuencia de infiltración de células inmunes del tejido tumoral 8, 9.
Otra alternativa es el uso de microscopía de campo brillante. Una ventaja de esta técnica sobre la formación de imágenes de fluorescencia es la ausencia de autofluorescencia del tejido. Aunque algunas muestras contienen más autofluorescencia, particularmente eritrocitos, pero también otros tipos de células, incluyendo granulocitos neutrófilos, estas áreas pueden ser fácilmente eliminadas en el análisis de casi todas las muestras. La inmunofluorescencia ofrece la ventaja de analizar marcadores múltiples en una muestra usando un panel de fluoresce dirigidoNt longitudes de onda. Esto es actualmente imposible en la misma medida para la microscopía de campo brillante debido a la falta de un número suficiente de marcadores y de isotipos de anticuerpos comercialmente disponibles para un antígeno particular.
La técnica de fluorescencia multicolor IHC descrita aquí se ha usado en muchos tipos diferentes de cáncer y combinaciones de anticuerpos para estudiar diferentes poblaciones de células inmunitarias, así como moléculas de células tumorales expresadas, tales como antígenos de leucocitos humanos (HLA) y PD-L1 10 , 11 , 12 . El protocolo se ha establecido y validado utilizando muchos tipos diferentes de muestras y anticuerpos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para el protocolo descrito, una de las etapas más críticas es determinar la dilución correcta de los anticuerpos primarios utilizados. La dilución de los anticuerpos secundarios marcados fue de 1: 200, según lo recomendado por el fabricante de estos anticuerpos específicos marcados con Alexa. La dilución de los anticuerpos primarios debe determinarse entonces mediante una dilución en serie, preferiblemente utilizando dos muestras diferentes del tipo de tejido deseado (en este caso, OPSCC). La dilución óptima d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt recibió el apoyo de la subvención UL2010-4801 de la Sociedad Holandesa contra el Cáncer. Agradecemos a todos los coautores del documento original que este protocolo JoVE esté basado en: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter y Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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