Immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs des sous-populations de lymphocytes T dans des échantillons de carcinome épidermique humain ou opharyngé humain fixé à la formaline, à base de formaline
Summary
L'immunohistochimie à fluorescence multiparamètre peut être utilisée pour évaluer le nombre, la répartition relative et la localisation des populations de cellules immunitaires dans le micro-environnement de la tumeur. Ce manuscrit décrit l'utilisation de cette technique pour analyser les sous-populations de cellules T dans le cancer de l'oropharynx.
Abstract
La technique d'immunohistochimie à fluorescence à quatre couleurs (IHC) est une méthode pour quantifier les populations cellulaires d'intérêt tout en tenant compte de leur répartition relative et de leur localisation dans le tissu. Cette technique a été largement appliquée pour étudier l'infiltration immunitaire dans divers types de tumeurs. Le microenvironnement tumoral est infiltré par des cellules immunitaires attirées par le site de la tumeur. On a constaté que différentes populations de cellules immunitaires jouent différents rôles dans le microenvironnement de la tumeur et ont un impact différent sur le résultat de la maladie. Ce manuscrit décrit l'utilisation de la fluorescence multiparamétrique IHC sur le carcinome épidermoïde oropharyngé (OPSCC) à titre d'exemple. Cette technique peut être étendue à d'autres échantillons de tissus et types d'intérêt cellulaire. Dans l'étude présentée, nous avons analysé le compartiment intra-épithélial et stromal d'une grande cohorte OPSCC (n = 162). Nous nous sommes concentrés sur les lymphocytes T complets (CD3 + ), le régulateur immunosuppresseur(Tregs, c'est-à-dire FoxP3 + ) et T helper 17 (Th17) ( c'est -à- dire IL-17 + CD3 + ) en utilisant un contre-cutané nucléaire pour distinguer l'épithélium tumoral du stroma. Un nombre élevé de cellules T s'est révélé être corrélée avec une survie sans maladie améliorée chez les patients avec un faible nombre de lymphocytes non-T IL-17 + intratumoraux. Cela suggère que les lymphocytes non-T IL-17 + peuvent être corrélés avec une mauvaise réponse immunitaire dans l'OPSCC, ce qui correspond à la corrélation décrite entre IL-17 et une survie médiocre chez les patients cancéreux. Actuellement, de nouvelles techniques IHC de fluorescence multiparamètres sont développées en utilisant jusqu'à 7 différents fluorochromes et permettront une caractérisation et une localisation plus précises des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral.
Introduction
Les carcinomes à cellules squameuses opharyngées (OPSCC) sont un groupe hétérogène de cancers des cellules squameuses originaires de l'oropharynx. Les facteurs de risque pour l'OPSCC comprennent l'infection par le papillomavirus humain (VPH) et l'alcool et le tabagisme 1 , 2 . Le rôle de la réponse immunitaire et la façon de l'utiliser dans un contexte clinique commencent à être explorés. Le micro-environnement de la tumeur est infiltré par des cellules immunitaires qui sont attirées par le site du cancer. Bien qu'une fréquence cytotoxique élevée de lymphocytes T CD8 + ait été corrélée avec une survie améliorée chez les patients OPSCC 3 , le rôle d'autres sous-ensembles de cellules T, y compris les cellules Treg et Th17, n'est toujours pas clair 4 . Alors que les cellules Th1 et Th17 sont censées aider à la réponse immunitaire ciblant les cellules tumorales, les Treg sont bien connus pour leurs capacités à supprimer l'activité d'autres lymphocytes T 5 . Cependant, la présence de TOn a constaté que les regs étaient corrélés avec des réponses favorables et défavorables dans différents types de tumeurs 6 . Étant donné que toutes les cellules immunitaires présentes dans le sang infiltrent la tumeur dans la même mesure, l'étude du micro-environnement local de la tumeur fournit la mesure la plus fiable de la réponse immunitaire dirigée contre la tumeur. L'objectif de cette étude est de déterminer la corrélation entre les nombres et les types de cellules immunitaires et les résultats cliniques. Nous avons utilisé l'imagerie IHC à fluorescence à quatre couleurs pour analyser le nombre et la localisation de diverses sous-populations de cellules T dans l'OPSCC humain.
Nous nous sommes concentrés sur les lymphocytes T totaux (CD3 + ), les cellules Th17 et les Tregs FoxP3 + immunosuppressifs, dont la voie de différenciation est étroitement liée aux cellules Th17. Les cellules Th17 se caractérisent par la combinaison de CD3 et d'IL-17. La cytokine IL-17 peut également être produite par des cellules non T 7 . Nous avons déterminé la distribution de l'intra-epitLes lymphocytes T de l'hélium et du stromal, les cellules non T Tregs, Th17 et IL-17 + dans une grande série de cas OPSCC et ont analysé les corrélations avec la survie du patient. La fluorescence multicouche IHC a été utilisée pour identifier l'expression de CD3, Foxp3 et IL-17, en combinaison avec un contre-tassement DAPI. Ce dosage a permis d'identifier facilement et clairement les cellules tumorales (en utilisant la coloration nucléaire DAPI) et les populations de cellules T infiltrantes (en utilisant une combinaison de marqueurs différents). Après la préparation et la coloration des échantillons, un microscope fluorescent et un logiciel d'imagerie ont été utilisés pour séparer les différentes couleurs fluorescentes utilisées et pour déterminer le nombre et le type de cellules présentes à la fois dans l'épithélium tumoral et dans le stroma associé à la tumeur.
Un autre essai pour quantifier et phénotype des populations de cellules immunitaires est l'analyse de cytométrie de flux, ou la cytométrie par analyse de temps de vol (CyTOF), d'échantillons de tumeurs ou de périphériques ( c.-à-d., Le sang ou l'ascite). En utilisant ceciTechnique, toutes les informations sur la localisation et la répartition relative des différents types de cellules sont perdues. L'utilisation et l'analyse des échantillons périphériques ne fournissent pas non plus d'informations sur les cellules susceptibles d'infiltrer le micro-environnement de la tumeur. Les analyses de cellules immunitaires de sang et d'ascite ont été montrées pour ne pas refléter le phénotype et la fréquence d'infiltration de cellules immunitaires du tissu tumoral 8 , 9 .
Une autre alternative est l'utilisation de microscopie à champ brillant. Un avantage de cette technique par rapport à l'imagerie par fluorescence est l'absence d'autofluorescence tissulaire. Bien que certains échantillons contiennent plus d'autofluorescence, en particulier les érythrocytes, mais aussi d'autres types de cellules, y compris les granulocytes neutrophiles, ces zones peuvent facilement être éliminées lors de l'analyse de presque tous les échantillons. L'immunofluorescence offre l'avantage d'analyser des marqueurs multiples dans un échantillon en utilisant un panel de fluorescence cibléeNt longueur d'onde. Ceci est actuellement impossible dans la même mesure pour le microscope à champ brillant en raison de l'absence d'un nombre suffisant d'étiquettes et d'isotypes d'anticorps disponibles dans le commerce pour un antigène particulier.
La technique de fluorescence multicouche IHC décrite ici a été utilisée dans de nombreux types de cancer différents et des combinaisons d'anticorps pour étudier différentes populations de cellules immunitaires, ainsi que des molécules exprimées par des cellules tumorales, telles que des antigènes de leucocytes humains (HLA) et PD-L1 10 , 11 , 12 . Le protocole a été établi et validé à l'aide de différents types d'échantillons et d'anticorps.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour le protocole décrit, l'une des étapes les plus critiques est de déterminer la dilution correcte des anticorps primaires utilisés. La dilution des anticorps secondaires marqués était de 1: 200, comme recommandé par le fabricant de ces anticorps spécifiques à l'Alexa. La dilution des anticorps primaires devrait ensuite être déterminée par une dilution en série, de préférence en utilisant deux échantillons différents du type de tissu souhaité (dans ce cas, OPSCC). La dilution de travail optim…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt a été soutenu par la licence UL2010-4801 de la Dutch Cancer Society. Nous tenons à remercier tous les coauteurs de l'article original selon lequel ce protocole JoVE est basé sur: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter et Sjoerd van Der Burg.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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