Четырехцветная флуоресценция Иммуногистохимия субпопуляций Т-клеток в архивных формалиновых фиксированных, парафиновых встраиваемых образцах проксимальной клеточной карциномы человека
Summary
Многопараметрическую флуоресцентную иммуногистохимию можно использовать для оценки количества, относительного распределения и локализации популяций иммунных клеток в микроокружении опухоли. В этой рукописи описывается использование этой методики для анализа субпопуляций Т-клеток при раке ротоглотки.
Abstract
Метод четырехцветной иммуногистохимии (IHC) представляет собой метод количественного определения популяций клеток с учетом их относительного распределения и их локализации в ткани. Этот метод широко применялся для изучения иммунного инфильтрата в различных типах опухолей. Микроокружение опухоли инфильтрируется иммунными клетками, которые притягиваются к месту опухоли. Было обнаружено, что различные популяции иммунных клеток играют разные роли в микроокружении опухоли и оказывают различное влияние на исход заболевания. В этой рукописи описывается использование многопараметрического флуоресцентного IHC на орофарингеальной плоскоклеточной карциноме (OPSCC) в качестве примера. Этот метод можно распространить на другие образцы тканей и интересующие их типы клеток. В представленном исследовании мы проанализировали внутриэпителиальный и стромальный отсек большой когорты OPSCC (n = 162). Мы сосредоточились на тотальных Т-лимфоцитах (CD3 + ), иммуносупрессивном регулате(Tregs, т. Е. FoxP3 + ), и Т-хелперных 17 (Th17) клеток ( т.е. IL-17 + CD3 + ), используя ядерную контрастность для выделения опухолевого эпителия из стромы. Было обнаружено, что большое количество Т-клеток коррелирует с улучшенной безрецидивной выживаемостью у пациентов с низким количеством внутриутробных IL-17 + не-Т-клеток. Это говорит о том, что IL-17 + не-Т-клетки могут коррелировать с плохим иммунным ответом в OPSCC, что согласуется с корреляцией, описанной между IL-17 и плохой выживаемостью у онкологических больных. В настоящее время разрабатываются новые многопараметрические методы флуоресценции IHC с использованием до 7 различных флюорохромов и позволят более точную характеристику и локализацию иммунных клеток в микроокружении опухоли.
Introduction
Орофарингеальная плоскоклеточная карцинома (OPSCC) представляет собой гетерогенную группу злокачественных клеток, возникающих в ротоглотке. Факторы риска для OPSCC включают инфекцию папилломы человека (ВПЧ) и употребление алкоголя и табака 1 , 2 . Роль иммунного ответа и того, как его использовать в клинических условиях, только начинает изучаться. Микроокружение опухоли инфильтрируется иммунными клетками, которые привлекаются к месту рака. Хотя высокая частота цитотоксических Т-клеток CD8 + коррелировала с улучшенной выживаемостью у пациентов с OPSCC 3 , роль других подтипов T-клеток, включая Tregs и клетки Th17, все еще не ясна 4 . В то время как клетки Th1 и Th17, как предполагается, помогают в иммунном ответе, нацеленном на опухолевые клетки, Tregs хорошо известны своими способностями подавлять активность других Т-клеток 5 . Однако наличие TБыло обнаружено, что regs коррелирует как с благоприятными, так и с неблагоприятными ответами в разных типах опухолей 6 . Поскольку не все иммунные клетки, присутствующие в крови, проникают в опухоль в одинаковой степени, изучение локального микроокружения опухоли обеспечивает наиболее надежную меру иммунного ответа, направленного против опухоли. Целью этого исследования является определение корреляции между числами и типами иммунных клеток и клиническим исходом. Мы использовали четырехцветную флюоресцентную визуализацию IHC для анализа количества и локализации различных субпопуляций Т-клеток в OPSCC человека.
Мы сосредоточились на тотальных Т-лимфоцитах (CD3 + ), клетках Th17 и иммуносупрессивных FoxP3 + Tregs, чей путь дифференцировки тесно связан с клетками Th17. Ячейки Th17 характеризуются комбинацией CD3 и IL-17. Цитокин IL-17 также может быть продуцирован не-Т-клетками 7 . Мы определили распределение внутриэпитныхГелиальные и стромальные Т-клетки, Tregs, Th17 и IL-17 + не-Т-клетки в большой серии случаев OPSCC и проанализировали корреляции с выживанием пациентов. Многоцветную флуоресценцию IHC использовали для идентификации экспрессии CD3, Foxp3 и IL-17 в комбинации с контрастирующим DAPI. Этот анализ позволил легко и четко идентифицировать как опухолевые клетки (с использованием ядерного окрашивания DAPI), так и популяции инфильтрирующих Т-клеток (с использованием комбинации разных маркеров). После подготовки образца и окрашивания использовали флуоресцентный микроскоп и программное обеспечение для визуализации для разделения различных используемых флуоресцентных цветов и определения количества и типа клеток, присутствующих как в опухолевом эпителии, так и в связанной с опухолью строме.
Альтернативным анализом количественных оценок и фенотипических популяций иммунных клеток является анализ проточной цитометрии или цитометрия по времени (CyTOF) анализ опухолевых или периферических образцов ( например, крови или асцита). Используя этоТехника, вся информация о локализации и относительном распределении различных типов клеток теряется. Использование и анализ периферических образцов также не дает информации о том, какие клетки способны проникать в микроокружение опухоли. Показано, что анализ клеток крови и асцитной иммунной клетки не отражает фенотип и частоту инфильтрации иммунной клетки опухолевой ткани 8 , 9 .
Другой альтернативой является использование микроскопии с ярким полем. Преимуществом этого метода в отношении флуоресцентной визуализации является отсутствие тканевой аутофлуоресценции. Хотя некоторые образцы содержат больше аутофлуоресценции, особенно эритроцитов, но также и других типов клеток, включая нейтрофильные гранулоциты, – эти области легко удаляются при анализе почти всех образцов. Иммунофлуоресценция дает преимущество анализа нескольких маркеров в одном образце с использованием панели целевого флуоресцированияNt длины волн. Это в настоящее время невозможно в той же степени для микроскопии с ярким полем из-за отсутствия достаточного количества меток и коммерчески доступных изотипов антител для конкретного антигена.
Многослойная флуоресцентная методика IHC, описанная здесь, была использована во многих различных типах рака и комбинациях антител для изучения различных популяций иммунных клеток, а также экспрессируемых опухолевыми клетками молекул, таких как человеческие лейкоцитарные антигены (HLA) и PD-L1 10 , 11 , 12 . Протокол был установлен и проверен с использованием различных типов образцов и антител.
Protocol
Representative Results
Discussion
Для описанного протокола одним из наиболее важных шагов является определение правильного разбавления используемых первичных антител. Разведение меченых вторичных антител составляло 1: 200, как рекомендовано изготовителем этих специфичных к Alexa антител. Затем разбавление первичных ан?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Симоне Пунт поддерживалась грантом UL2010-4801 от Нидерландского онкологического общества. Мы хотели бы поблагодарить всех соавторов оригинальной статьи, что этот протокол JoVE основан на: Эмили А. Дронкерсе, Марии Дж. П. Уэлтерсе, Ренске Годемане, Сенаде Коленовиче, Елизавете Блумене, Питере Дж. Ф. Снейдерсе, Арко Гортере и Сьёрд ван Дер Бург.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?. Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?. Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. . Essential Medical Statistics. , (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. . Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
