档案福尔马林固定，石蜡包埋的人类口咽鳞状细胞癌样品中T细胞亚群的四色荧光免疫组织化学
Summary
多参数荧光免疫组织化学可用于评估肿瘤微环境中免疫细胞群体的数量，相对分布和定位。该手稿描述了使用这种技术来分析口咽癌中的T细胞亚群。
Abstract
四色荧光免疫组织化学（IHC）技术是一种量化目标细胞群的方法，同时考虑到其相对分布及其在组织中的定位。该技术已被广泛应用于研究各种肿瘤类型的免疫浸润。肿瘤微环境被吸引到肿瘤部位的免疫细胞浸润。已经发现不同的免疫细胞群体在肿瘤微环境中发挥不同的作用，并且对疾病的结果具有不同的影响。本手册以口咽鳞状细胞癌（OPSCC）为例介绍了多参数荧光IHC的应用。该技术可以扩展到其他组织样本和感兴趣的细胞类型。在本研究中，我们分析了大型OPSCC队列的上皮内和间质隔室（n = 162）。我们专注于总T淋巴细胞（CD3 + ），免疫抑制调节（Tregs， 即 FoxP3 + ）和T辅助细胞17（Th17）细胞（ 即 IL-17 + CD3 + ），使用核复染色体将肿瘤上皮细胞与基质区分开来。发现大量的T细胞与肿瘤内IL-17 +非T细胞数量较少的患者的无病生存率相关。这表明IL-17 +非T细胞可能与OPSCC中的不良免疫反应相关，这与IL-17和癌症患者的存活率差相关。目前，正在开发使用多达7种不同荧光染料的新型多参数荧光IHC技术，并且能够使肿瘤微环境中的免疫细胞更精确地表征和定位。
Introduction
口咽鳞状细胞癌（OPSCC）是起源于口咽部的鳞状细胞癌的异质组。危险因素包括OPSCC人乳头瘤病毒（HPV）感染和使用酒精和烟草1,2。免疫反应的作用以及如何在临床环境中使用这种作用刚刚开始探索。肿瘤微环境被吸引到癌症部位的免疫细胞渗透。尽管高CD8 +细胞毒性T细胞频率已经与OPSCC患者3的改善生存率相关，但其他T细胞亚群（包括Treg和Th17细胞）的作用尚不清楚4 。而Th1和Th17细胞被认为有助于靶向肿瘤细胞的免疫应答，Treg因其抑制其他T细胞活性的能力而众所周知5 。但是，T的存在暂存器已经发现，在不同的肿瘤类型6有利和不利的响应相关。由于并非所有存在于血液中的免疫细胞以相同的程度渗透到肿瘤中，所以研究局部肿瘤微环境提供了针对肿瘤的免疫应答的最可靠的测量。本研究的目的是确定免疫细胞数量和类型与临床结果之间的相关性。我们使用四色荧光IHC成像分析人类OPSCC中各种T细胞亚群的数量和定位。
我们专注于总T淋巴细胞（CD3 + ），Th17细胞和免疫抑制性FoxP3 + Treg，其分化途径与Th17细胞密切相关。 Th17细胞的特征在于CD3和IL-17的组合。细胞因子IL-17也可以由非T细胞产生7 。我们确定了intra-epit的分布在一系列OPSCC病例中的Helic和基质T细胞，Treg，Th17和IL-17 +非T细胞，并分析与患者生存的相关性。多色荧光IHC用于鉴定CD3，Foxp3和IL-17的表达，与DAPI复染色结合。该测定允许容易且清楚地鉴定肿瘤细胞（使用DAPI核染色）和浸润性T细胞群体（使用不同标记物的组合）。样品制备和染色后，使用荧光显微镜和成像软件分离所使用的不同荧光颜色，并确定存在于肿瘤上皮细胞和肿瘤相关基质中的细胞的数量和类型。
用于量化和表型免疫细胞群体的替代测定法是通过肿瘤或外周样品（ 即血液或腹水）的流式细胞术分析或通过飞行时间（CyTOF）分析的细胞计数。使用这个技术，丢失了关于不同细胞类型的定位和相对分布的所有信息。外周样品的使用和分析也不提供关于哪些细胞能够渗透肿瘤微环境的信息。血液和腹水免疫细胞的分析已经示出不以反映肿瘤组织8,9的免疫细胞浸润的表型和频率。
另一个选择是使用明视野显微镜。这种技术优于荧光成像的优点是没有组织自体荧光。虽然一些样品含有更多的自发荧光 – 特别是红细胞，但也包括其他细胞类型，包括嗜中性粒细胞 – 这些区域可以在几乎所有样品的分析中容易地去除。免疫荧光提供了通过使用一组靶向荧光分析一个样品中的多个标记物的优点nt波长。由于缺乏足够数量的标记物和用于特定抗原的商业上可获得的抗体同种型，目前对于明视野显微术来说，这是不可能的。
这里所描述的多色荧光IHC技术已在许多不同的癌症类型和抗体组合被用于研究不同的免疫细胞群，以及肿瘤细胞表达的分子，如人白细胞抗原（HLA）和PD-L1 10，11， 12 。该方案已经使用许多不同类型的样品和抗体建立和验证。
Protocol
Representative Results
Discussion
对于所述的方案，最关键的步骤之一是确定所使用的一抗的正确稀释度。标记的二次抗体的稀释度为1:200，如这些特异性Alexa标记的抗体的制造商所推荐的。然后通过连续稀释来确定一抗的稀释度，优选使用两种不同样本的预期组织类型（在这种情况下，OPSCC）。最佳工作稀释度是在没有背景噪声的情况下获得清除信号并且在相同浓度下没有阴性对照的信号的稀释。根据可用的显微镜类型和研?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt得到荷兰癌症协会授予的UL2010-4801的支持。我们要感谢原始论文的所有合作者，这份JoVE协议基于：Emilie A.Dronkers，Marij JP Welters，Renske Goedemans，SenadaKoljenović，Elisabeth Bloemena，Peter JF Snijders，Arko Gorter和Sjoerd van德伯格
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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