أربعة ألوان مضان المناعية من الخلايا السكانية الفرعية T- خلية في الأرشيفية الفورمالين ثابتة، جزءا لا يتجزأ من البارافين الإنسان البلعوم الخلايا الحرشفية سرطان الخلايا العينات
Summary
ويمكن استخدام متعدد المناعية مضان المناعية لتقييم عدد والتوزيع النسبي، وتوطين السكان الخلايا المناعية في المكروية الورم. تصف هذه المخطوطة استخدام هذه التقنية لتحليل المجموعات الفرعية من الخلايا التائية في سرطان البلعوم.
Abstract
تقنية مضان أربعة ألوان مضان (إهك) هي طريقة لقياس السكان الخلية من الفائدة مع الأخذ بعين الاعتبار توزيعها النسبي وتوطينها في الأنسجة. وقد تم تطبيق هذه التقنية على نطاق واسع لدراسة التسلل المناعي في مختلف أنواع الورم. يتم تسلل المكروية الورم بواسطة الخلايا المناعية التي تنجذب إلى موقع الورم. وقد تم العثور على مختلف السكان الخلايا المناعية للعب أدوارا مختلفة في المكروية الورم ويكون لها تأثير مختلف على نتائج المرض. تصف هذه المخطوطة استخدام مضان متعدد الأوجه إهك على سرطان الخلايا الحرشفية البلعوم (أوبسك) كمثال على ذلك. ويمكن تمديد هذه التقنية إلى عينات الأنسجة الأخرى وأنواع الخلايا من الفائدة. في الدراسة المقدمة، قمنا بتحليل المقصورة داخل الظهارية و اللحمية من مجموعة أبسك كبيرة (ن = 162). ركزنا على مجموع الخلايا الليمفاوية T (CD3 + )، منظم مناعةأوري T الخلايا (Tregs، أي FoxP3 +)، والخلايا التائية المساعدة 17 (Th17) (أي، IL-17 + CD3 +) باستخدام مباين النووية للتمييز ظهارة الورم من سدى. تم العثور على عدد كبير من الخلايا التائية لتكون مرتبطة مع تحسن البقاء على قيد الحياة خالية من الأمراض في المرضى الذين يعانون من عدد قليل من الخلايا إنتيرومورال إيل-17 + غير T. هذا يشير إلى أن إيل-17 + الخلايا غير T قد تكون مرتبطة مع استجابة مناعية ضعيفة في أوبسك، والذي يتفق مع الارتباط الموصوف بين إيل-17 وضعف البقاء على قيد الحياة في مرضى السرطان. حاليا، ويجري تطوير تقنيات متعددة إهك مضان متعدد المسارات إهك باستخدام ما يصل إلى 7 فلوروكروميس مختلفة وسوف تمكن توصيف أكثر دقة وتوطين الخلايا المناعية في المكروية الورم.
Introduction
سرطان الخلايا الحرشفية البلعومية (أوبسكس) هي مجموعة غير متجانسة من سرطانات الخلايا الحرشفية التي تنشأ في البلعوم. عوامل الخطر ل أوبسك تشمل فيروس الورم الحليمي البشري (فيروس الورم الحليمي البشري) والكحول والتبغ استخدام 1 ، 2 . دور الاستجابة المناعية وكيفية استخدام هذا في الإعداد السريري هو مجرد بداية لاستكشافها. يتم تسلل المكروية الورم من قبل الخلايا المناعية التي تنجذب إلى موقع السرطان. على الرغم من أن ارتفاع CD8 + السامة للخلايا T- تردد الخلية قد ارتبط مع تحسين البقاء على قيد الحياة في المرضى أوبسك 3 ، ودور مجموعات فرعية أخرى الخلايا التائية، بما في ذلك خلايا تريجس و TH17، لا يزال غير واضح 4 . في حين أن من المفترض أن TH1 و Th17 الخلايا للمساعدة في الاستجابة المناعية التي تستهدف الخلايا السرطانية، تريجس معروفة جيدا لقدراتهم لقمع نشاط الخلايا التائية الأخرى 5 . ومع ذلك، فإن وجود Tتم العثور على السجلات التي ترتبط مع كل من ردود مواتية وغير مواتية في أنواع ورم مختلفة 6 . وبما أن جميع الخلايا المناعية الموجودة في الدم لا تسلل الورم إلى نفس الدرجة، فإن دراسة المكروية المحلية للورم توفر المقياس الأكثر موثوقية للاستجابة المناعية الموجهة ضد الورم. والهدف من هذه الدراسة هو تحديد العلاقة بين أعداد وأنواع الخلايا المناعية والنتيجة السريرية. استخدمنا أربعة ألوان التصوير إهك مضان لتحليل عدد وتوطين مختلف المجموعات السكانية T- الخلية في أوبسك الإنسان.
ركزنا على مجموع الخلايا الليمفاوية التائية (CD3 + )، والخلايا TH17، ومناعة الثعلب FoxP3 + تريجس، الذي يرتبط مسار التمايز ارتباطا وثيقا بخلايا TH17. وتتميز خلايا TH17 من خلال الجمع بين CD3 و إيل-17. ويمكن أيضا أن تنتج السيتوكين إيل-17 من قبل الخلايا غير T- 7 . قررنا توزيع داخل الحلقةوالخلايا التائية الحلزونية والانسجة، تريجس، Th17، و إيل-17 + الخلايا غير التائية في سلسلة كبيرة من الحالات أوبسك وتحليل الارتباطات مع بقاء المريض. تم استخدام مضان متعدد الألوان إهك لتحديد التعبير عن CD3، Foxp3، و إيل-17، في تركيبة مع دابير كونترستين. يسمح هذا الفحص لتحديد سهل وواضح من كل من الخلايا السرطانية (باستخدام دابي تلطيخ النووية) وتسلل السكان الخلايا التائية (باستخدام مزيج من علامات مختلفة). بعد إعداد العينة وتلطيخ، تم استخدام المجهر الفلورسنت وبرامج التصوير لفصل الألوان الفلورية المختلفة المستخدمة وتحديد عدد ونوع الخلايا الموجودة في كل من ظهارة الورم والورم المرتبطة سدى.
فحص بديل لتحديد والنمط الظاهري السكان الخلايا المناعية هو تحليل التدفق الخلوي، أو الخلوي من وقت تحليل الرحلة (سيتوف)، من الورم أو العينات الطرفية ( أي الدم أو استسقاء). باستخدام هذاتقنية، يتم فقدان جميع المعلومات حول التعريب والتوزيع النسبي لأنواع الخلايا المختلفة. استخدام وتحليل العينات الطرفية أيضا لا توفر معلومات حول الخلايا التي هي قادرة على التسلل المكروية الورم. وقد أظهرت التحاليل الدم والاستسقاء المناعة المناعية لا تعكس النمط الظاهري وتواتر تسلل الخلايا المناعية للأنسجة الورم 8 ، 9 .
بديل آخر هو استخدام المجهر مشرق الميدان. ميزة هذه التقنية على التصوير مضان هو عدم وجود تألق الأنسجة. على الرغم من أن بعض العينات تحتوي على مزيد من التألق الذاتي، وخاصة الكريات الحمراء، ولكن أيضا أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك المحببة العدلات، ويمكن بسهولة إزالة هذه المناطق في تحليل جميع العينات تقريبا. يوفر المناعي ميزة تحليل علامات متعددة في عينة واحدة باستخدام لوحة من الفلور المستهدفةنت الطول الموجي. هذا مستحيل في الوقت الراهن إلى نفس المدى للمجهر الميدان مشرق نظرا لعدم وجود عدد كاف من التسميات والأنماط النمط المضاد المتاحة تجاريا لمستضد معين.
وقد استخدمت تقنية إهك مضان متعدد الألوان وصفها هنا في العديد من أنواع السرطان المختلفة ومجموعات الأجسام المضادة لدراسة مختلف السكان الخلايا المناعية، فضلا عن الجزيئات السرطانية أعرب عن الورم، مثل مستضدات الكريات البيض البشرية (هلا) و بد-L1 10 ، 11 ، 12 – وقد تم إنشاء بروتوكول والتحقق من صحتها باستخدام العديد من أنواع مختلفة من العينات والأجسام المضادة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لبروتوكول وصفها، واحدة من الخطوات الأكثر أهمية هو تحديد التخفيف الصحيح من الأجسام المضادة الأولية المستخدمة. كان التخفيف من الأجسام المضادة الثانوية المسمى 1: 200، على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة لهذه الأجسام المضادة المسمى اليكسا محددة. وينبغي بعد ذلك تحدي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم سيمون بانت من قبل UL2010-4801 منحة من جمعية السرطان الهولندية. نود أن نشكر جميع المؤلفين المشاركين في الورقة الأصلية أن هذا البروتوكول جوف يستند إلى: إميلي أ. درونكرز، ماريج جب ويلترز، رينسكي غوديمانز، سينادا كولينوفيتش، إليزابيث بلومينا، بيتر جف سنيجدرز، أركو غورتر، وسجورد فان دير بورغ.
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
- Westra, W. H. The changing face of head and neck cancer in the 21st century: the impact of HPV on the epidemiology and pathology of oral cancer. Head Neck Pathol. 3 (1), 78-81 (2009).
- Rietbergen, M. M., et al. Human papillomavirus detection and comorbidity: critical issues in selection of patients with oropharyngeal cancer for treatment De-escalation trials. Ann Oncol. 24 (11), 2740-2745 (2013).
- Wallis, S. P., Stafford, N. D., Greenman, J. Clinical relevance of immune parameters in the tumor microenvironment of head and neck cancers. Head Neck. 37 (3), 449-459 (2015).
- Ye, J., Livergood, R. S., Peng, G. The role and regulation of human Th17 cells in tumor immunity. Am J Pathol. 182 (1), 10-20 (2013).
- Amedei, A., et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancer-infiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 62 (7), 1249-1260 (2013).
- Whiteside, T. L. What are regulatory T cells (Treg) regulating in cancer and why?. Semin Cancer Biol. 22 (4), 327-334 (2012).
- Punt, S., et al. Angels and demons: Th17 cells represent a beneficial response, while neutrophil IL-17 is associated with poor prognosis in squamous cervical cancer. Oncoimmunology. 4 (1), e984539 (2015).
- Bamias, A., et al. Significant differences of lymphocytes isolated from ascites of patients with ovarian cancer compared to blood and tumor lymphocytes. Association of CD3+CD56+ cells with platinum resistance. Gynecol Oncol. 106 (1), 75-81 (2007).
- Gasparoto, T. H., et al. Patients with oral squamous cell carcinoma are characterized by increased frequency of suppressive regulatory T cells in the blood and tumor microenvironment. Cancer Immunol Immunother. 59 (6), 819-828 (2010).
- Jordanova, E. S., et al. Human leukocyte antigen class I, MHC class I chain-related molecule A, and CD8+/regulatory T-cell ratio: which variable determines survival of cervical cancer patients?. Clin Cancer Res. 14 (7), 2028-2035 (2008).
- van Esch, E. M., et al. Alterations in classical and nonclassical HLA expression in recurrent and progressive HPV-induced usual vulvar intraepithelial neoplasia and implications for immunotherapy. Int J Cancer. 135 (4), 830-842 (2014).
- Heeren, A. M., et al. Prognostic effect of different PD-L1 expression patterns in squamous cell carcinoma and adenocarcinoma of the cervix. Mod Pathol. 29 (7), 753-763 (2016).
- Punt, S., et al. A beneficial tumor microenvironment in oropharyngeal squamous cell carcinoma is characterized by a high T cell and low IL-17(+) cell frequency. Cancer Immunol Immunother. 65 (4), 393-403 (2016).
- Kirkwood, B. R., Sterne, J. A. C. . Essential Medical Statistics. , (2003).
- Kleinbaum, D. G., Klein, M. . Survival Analysis: A Self-Learning Text. , (2005).
- Fabre, J., et al. Targeting the Tumor Microenvironment: The Protumor Effects of IL-17 Related to Cancer Type. Int J Mol Sci. 17 (9), (2016).
- Feng, Z., et al. Multispectral imaging of formalin-fixed tissue predicts ability to generate tumor-infiltrating lymphocytes from melanoma. J Immunother Cancer. 3 (47), (2015).
