Vier-Farb-Fluoreszenz-Immunhistochemie von T-Zell-Subpopulationen im Archiv Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete menschliche Oropharynx-Plattenepithelkarzinom-Proben
Summary
Multiparameter-Fluoreszenz-Immunhistochemie kann verwendet werden, um die Anzahl, die relative Verteilung und die Lokalisierung von Immunzellpopulationen in der Tumor-Mikroumgebung zu bestimmen. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung dieser Technik zur Analyse von T-Zell-Subpopulationen bei oropharyngealen Krebs.
Abstract
Die vierfarbige Fluoreszenz-Immunhistochemie (IHC) -Technik ist eine Methode zur Quantifizierung von Zellpopulationen von Interesse unter Berücksichtigung ihrer relativen Verteilung und ihrer Lokalisierung im Gewebe. Diese Technik wurde intensiv angewendet, um das Immun-Infiltrat in verschiedenen Tumortypen zu untersuchen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an die Tumorstelle angezogen werden. Verschiedene Immunzellenpopulationen wurden gefunden, um unterschiedliche Rollen in der Tumor-Mikroumgebung zu spielen und einen anderen Einfluss auf das Ergebnis der Erkrankung zu haben. Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von Multiparameter-Fluoreszenz-IHC auf oropharyngealem Plattenepithelkarzinom (OPSCC) als Beispiel. Diese Technik kann auf andere Gewebeproben und Zelltypen von Interesse erweitert werden. In der vorgestellten Studie analysierten wir das intraepitheliale und stromale Kompartiment einer großen OPSCC-Kohorte (n = 162). Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), immunsuppressive RegulationOry T-Zellen (Tregs, dh FoxP3 + ) und T-Helfer 17 (Th17) -Zellen ( dh IL-17 + CD3 + ) unter Verwendung eines nuklearen Gegenstiftes zur Unterscheidung von Tumorepithel aus Stroma. Es wurde festgestellt, dass eine hohe Anzahl von T-Zellen mit einem verbesserten krankheitsfreien Überleben bei Patienten mit einer geringen Anzahl von intratumoralen IL-17 + Nicht-T-Zellen korreliert wurde. Dies deutet darauf hin, dass IL-17 + Nicht-T-Zellen mit einer schlechten Immunantwort in OPSCC korreliert werden können, was mit der Korrelation zwischen IL-17 und dem schlechten Überleben bei Krebspatienten übereinstimmt. Derzeit werden neuartige Multiparameter-Fluoreszenz-IHC-Techniken mit bis zu 7 verschiedenen Fluorochromen entwickelt und ermöglichen die präzisere Charakterisierung und Lokalisierung von Immunzellen in der Tumor-Mikroumgebung.
Introduction
Oropharyngeale Plattenepithelkarzinome (OPSCCs) sind eine heterogene Gruppe von Plattenepithelkarzinomen, die aus dem Oropharynx stammen. Risikofaktoren für OPSCC umfassen humanes Papillomavirus (HPV) Infektion und Alkohol und Tabakkonsum 1 , 2 . Die Rolle der Immunantwort und wie man sie in einer klinischen Umgebung einsetzt, beginnt erst zu erforschen. Die Tumor-Mikroumgebung wird durch Immunzellen infiltriert, die an der Krebs-Stelle angezogen werden. Obwohl eine hohe CD8 + zytotoxische T-Zell-Frequenz mit einem verbesserten Überleben bei OPSCC-Patienten 3 korreliert wurde, ist die Rolle anderer T-Zell-Teilmengen, einschließlich Tregs und Th17-Zellen, noch unklar 4 . Während Th1- und Th17-Zellen in der Immunantwort-Targeting-Tumorzellen helfen sollen, sind Tregs für ihre Fähigkeiten bekannt, um die Aktivität anderer T-Zellen zu unterdrücken 5 . Die Anwesenheit von TRegs wurde gefunden, um mit günstigen und ungünstigen Reaktionen in verschiedenen Tumortypen zu korrelieren 6 . Da nicht alle im Blut vorhandenen Immunzellen den Tumor in gleichem Maße infiltrieren, liefert das Studium der lokalen Tumor-Mikroumgebung das zuverlässigste Maß für die gegen das Tumor gerichtete Immunantwort. Das Ziel dieser Studie ist es, die Korrelation zwischen den Zahlen und Arten der Immunzellen und dem klinischen Ergebnis zu bestimmen. Wir verwendeten vierfarbige Fluoreszenz-IHC-Bildgebung, um die Anzahl und Lokalisierung verschiedener T-Zell-Subpopulationen in humanem OPSCC zu analysieren.
Wir konzentrierten uns auf totale T-Lymphozyten (CD3 + ), Th17-Zellen und immunsuppressive FoxP3 + Tregs, deren Differenzierungsweg eng mit Th17-Zellen verwandt ist. Th17-Zellen zeichnen sich durch die Kombination von CD3 und IL-17 aus. Das Cytokin IL-17 kann auch durch Nicht-T-Zellen 7 hergestellt werden . Wir haben die Verteilung der Intra-Epitierung bestimmtHelialen und stromalen T-Zellen, Tregs, Th17 und IL-17 + Nicht-T-Zellen in einer großen Reihe von OPSCC-Fällen und analysierten die Korrelationen mit dem Überleben des Patienten. Mehrfarbige Fluoreszenz IHC wurde verwendet, um die Expression von CD3, Foxp3 und IL-17 in Kombination mit einem DAPI-Gegenfleck zu identifizieren. Dieser Assay erlaubte die einfache und klare Identifizierung von beiden Tumorzellen (unter Verwendung von DAPI-Kernfärbung) und der infiltrierenden T-Zellpopulationen (unter Verwendung einer Kombination verschiedener Marker). Nach der Probenvorbereitung und der Färbung wurde ein Fluoreszenzmikroskop und eine Imaging-Software verwendet, um die verschiedenen verwendeten Fluoreszenzfarben zu trennen und die Anzahl und den Typ der Zellen zu bestimmen, die sowohl im Tumorepithel als auch im Tumor-assoziierten Stroma vorhanden waren.
Ein alternativer Assay zur Quantifizierung und Phänotypen von Immunzellpopulationen ist die Durchflusszytometrieanalyse oder die Zytometrie nach der Zeit des Fluges (CyTOF) -Analyse von Tumor- oder peripheren Proben ( dh Blut oder Aszites). Mit diesemTechnik, alle Informationen über die Lokalisierung und die relative Verteilung der verschiedenen Zelltypen geht verloren. Die Verwendung und Analyse von peripheren Proben liefert auch keine Information darüber, welche Zellen in der Lage sind, die Tumor-Mikroumgebung zu infiltrieren. Blut- und Ascite-Immunzellenanalysen haben gezeigt, dass sie nicht den Phänotyp und die Häufigkeit der Immunzelleninfiltration des Tumorgewebes 8 , 9 widerspiegeln.
Eine weitere Alternative ist die Verwendung von Hellfeldmikroskopie. Ein Vorteil dieser Technik gegenüber der Fluoreszenz-Bildgebung ist die Abwesenheit von Gewebe-Autofluoreszenz. Obwohl einige Proben mehr Autofluoreszenz – insbesondere Erythrozyten, aber auch andere Zelltypen enthalten, einschließlich neutrophiler Granulozyten – können diese Bereiche bei der Analyse fast aller Proben leicht entfernt werden. Immunfluoreszenz bietet den Vorteil, mehrere Marker in einer Probe zu analysieren, indem ein Panel mit gezielter Fluoreszenz verwendet wirdNt Wellenlängen. Dies ist derzeit in gleichem Maße für die Hellfeldmikroskopie aufgrund des Fehlens einer ausreichenden Anzahl von Etiketten und handelsüblichen Antikörper-Isotypen für ein bestimmtes Antigen unmöglich.
Die hier beschriebene mehrfarbige Fluoreszenz-IHC-Technik wurde in vielen verschiedenen Krebsarten und Antikörperkombinationen verwendet, um verschiedene Immunzellpopulationen sowie Tumorzell-exprimierte Moleküle wie menschliche Leukozytenantigene (HLA) und PD-L1 10 , 11 , 12 Das Protokoll wurde mit vielen verschiedenen Arten von Proben und Antikörpern etabliert und validiert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Für das beschriebene Protokoll ist eines der kritischsten Schritte, um die korrekte Verdünnung der verwendeten primären Antikörper zu bestimmen. Die Verdünnung der markierten Sekundärantikörper betrug 1: 200, wie vom Hersteller dieser spezifischen Alexa-markierten Antikörper empfohlen. Die Verdünnung der primären Antikörper sollte dann durch eine serielle Verdünnung bestimmt werden, vorzugsweise unter Verwendung von zwei verschiedenen Proben des beabsichtigten Gewebetyps (in diesem Fall OPSCC). Die optimale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Simone Punt wurde von der Niederlassung UL2010-4801 von der niederländischen Krebsgesellschaft unterstützt. Wir danken allen Co-Autoren des Originalpapiers, auf denen dieses JoVE-Protokoll basiert: Emilie A. Dronkers, Marij JP Welters, Renske Goedemans, Senada Koljenović, Elisabeth Bloemena, Peter JF Snijders, Arko Gorter und Sjoerd van Der Burg
Materials
| Pathos Delta Ultra Rapid Tissue Processor | Milestone and Histostar | Automated tissue processor | |
| Histostar | Thermo Scientific | Tissue block embedding machine | |
| Formaldehyde | Baker | ||
| Xylol | Merck | ||
| Ethanol | Merck | ||
| milliQ water | Elaga Purelab Chorus | ||
| Paraffin wax/Paraclean | Klinipath | 5079A | |
| Microtome tissue holder | Leica | RM225 | |
| Flex IHC side | Dako | Tissue slide | |
| Tris | Merk-Milipore | 1,083,821,000 | |
| EDTA | Baker | 1073 | |
| PBS | Bio-Rad | BUF036A | |
| BSA | Sigma | A9647 | |
| Rabbit anti-CD3 | Abcam | ab828 | Titrate required antibody dilution |
| Mouse IgG1 anti-FoxP3 | Abcam | ab20034 | Titrate required antibody dilution |
| Goat IgG anti-IL-17 | R&D Systems | AF-317-NA | Titrate required antibody dilution |
| Rabbit Ig isotype control antibody | Abcam | ab27472 | Use at same final concentration as anti-CD3 |
| Mouse IgG1 isotype control antibody | Abcam | ab91353 | Use at same final concentration as anti-FoxP3 |
| Goat IgG isotype control antibody | ThermoFisher Scientific | 02-6202 | Use at same final concentration as anti-IL-17 |
| Donkey anti-rabbit IgG A546 | ThermoFisher Scientific | A10040 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-mouse-A647 | ThermoFisher Scientific | A31571 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| Donkey anti-goat IgG A488 | ThermoFisher Scientific | A11055 | Dilute 1:200 in 1% BSA/PBS |
| VectaShield containing DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| LSM700 confocal laser scanning microscope | Zeiss | ||
| LCI Plan-Neofluar 25x/0.8 Imm Korr DIC M27 objective | Zeiss | 420852-9972-720 | |
| LSM Zen Software | Zeiss | version 2009 | |
| LSM Image Browser | Zeiss | version 4.2.0.121 | Available to download at www.zeiss.com/microscopy/int/website/downloads/lsm-image-browser.html. |
| SPSS | IBM Corp. | version 20.0 | |
| ImageJ | version 1.50i | Available to download at http://rsb.info.nih.gov/ij. |
References
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