Summary

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup> 64</sup> Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em> In Vivo</em> PET / CT ile hücre Trafik

Published: April 29, 2017
doi:

Summary

Bir transgenik fare, T hücresi reseptörüne bağlanan bir 64Cu-modifiye edilmiş monoklonal antikorun hazırlanmasını takiben, T hücreleri, canlılık, fonksiyonellik, etiketleme stabilitesi ve apoptoz için analiz, in vivo olarak radyoaktif işaretli olan ve adoptif bir nefes yolu gecikmeli tipte aşırı duyarlılık ile farelere aktarıldı pozitron emisyon tomografisi / bilgisayarlı tomografi (PET / BT) ile invazif olmayan görüntüleme için reaksiyon.

Abstract

Bu protokol, 64Cu üretimini ve kemirgen lenfosit hücre kültürü ve hücre hedefleme 64Cu-reseptörün ardından bir monoklonal antikor (mAb) şelatlayıcı çekimi / Radyo-etiketlenmesi göstermektedir. PET / CT ile bir hava yolu gecikmiş tip aşın duyarlılık reaksiyonunda (DTHR) bir hayvan modelinde radyo-etiket, ve in vivo hücre takibi yayılmayan açıklanmaktadır in vitro değerlendirilmesi.

Ayrıntılı olarak, şelatlayıcı 1,4,7,10-tetraazasiklododekan-1,4,7,10-tetraasetik asit (DOTA) bir mAb konjugasyon gösterilmiştir. Radyoaktif 64 Cu, DOTA-konjuge mAb'nin radyoaktif üretimini sonra tarif edilmektedir. Daha sonra, tavuk ovalbumin (cova) e özgü CD4 + interferon genişlemesi (IFN) -γ-üreten T yardımcı hücreleri (cova-TH1) ve cova-TH1 hücrelerinin daha sonra, radyo-etiketleme olarak gösterilmiştir. Çeşitli in vitro teknikler ef değerlendirmek için sunulmuşturtripan mavi dışlama hücre canlılığının belirlenmesi, akış sitometrisi için Annexin V ile apoptosis için boyama ve IFN-γ enzime bağlı immünosorban tahliliyle özelliklerin değerlendirilmesi gibi hücreler üzerinde 64Cu-radyo sınıflandırılmasıyla tama yaptığı, (ELISA) . Bundan başka, hücre içine radyoaktivite alımının ve markalama kararlılığının belirlenmesi detaylı olarak tarif edilmektedir. Bu protokol daha nedenle, BALB / c farelerinde cova kaynaklı akut solunum yolu DHTR indüksiyonu dahil, bir hava yolu DTHR için bir hayvan modeli olarak, hücre izleme çalışmaları yapmak ve açıklamaktadır. Son olarak, görüntü elde etme, yeniden yapılanma, ve analizi dahil sağlam PET / BT iş akışı sunulmuştur.

Daha sonra alıcı içselleştirme 64 Cu-antikor reseptörü hedefleyen bir yaklaşım, hücre etiketlenmesi için ortak PET izleyiciler kıyasla yüksek spesifite ve stabilite, düşük hücre toksisitesi ve düşük akış oranlarını sağlar, örneğin, 64Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Son olarak, yaklaşım, 48 saat için optimum sinyal-zemin oranı PET / CT ile in vivo hücre takibi yayılmayan sağlar. Bu deneysel yaklaşım içselleştirilir membrana bağlı reseptör ile hayvan modelleri ve hücre tipleri farklı transfer edilebilir.

Introduction

Invazif olmayan hücre takibi, in vivo olarak, hücre fonksiyonu, göç ve homing izlemek için çok yönlü bir araçtır. Son hücre takibi çalışmaları rejeneratif tıpta, kanser, 3, 4 karşı adoptif hücre tedavileri enflamasyonun veya T lenfositleri otolog periferik beyaz kan hücreleri bağlamında mesenkimal 1, 2 ya da kemik iliği kökenli kök hücreleri 3 üzerine odaklanmıştır. eylem siteleri ve hücre tabanlı tedaviler yatan biyolojik ilkelerin aydınlatılması muazzam öneme sahiptir. CD8 + sitotoksik T lenfositleri, genetik olarak yaygın altın standart olarak kabul edilmiştir kimerik antijen reseptörü (CAR), T hücreleri ya da tümör infiltre edici lenfositler (TILler) tasarlanmıştır. Bununla birlikte, tümör bağlantılı antijen-spesifik Th1 hücrelerinin <etkili bir tedavi seçeneği 4, olduğu kanıtlanmıştır/ sup> 5, 6, 7.

Anahtar iltihaplanmada oyuncuların organa özgü otoimmün bir hastalık (örneğin, romatoid artrit veya bronşiyal astım) ve kanser immünoterapisi yüksek ilgi hücreleri gibi, TH1 hücre zamansal dağılımı ve yerleşme kalıpları karakterize etmek için önemlidir. PET ile invaziv olmayan in vivo görüntüleme in vivo hominginde, hücre göçü modellerini incelemek için bir nicel, çok hassas bir yöntem 8. sunulur, ve iltihap, alerji, enfeksiyon ya da tümör rejeksiyon 9, 10, 11 sırasında T hücresi eylem ve tepkilerinin siteleri.

Klinik olarak, In-oksin 111 2-deoksi-2- (18 ise, iltihap ve enfeksiyon 12 ayrımı için lökosit sintigrafisi için kullanılırF)-floro-D-glükoz (18F-FDG) genellikle PET 3, 13 ile hücre izleme çalışmaları için kullanılır. Bu PET tracer önemli bir dezavantajı, ancak, 109.7 dk'da radyonüklid 18F ve daha sonraki zaman noktalarında görüntüleme adoptif hücre transferi sonrası engelleyen düşük hücre içi stabilite kısa yarılanma ömrü. Hücrelerde kararsız olmasına rağmen, 64Cu-PTSM sık sık kullanılan PET ile in vivo hücre takibi çalışmalarında uzun vadede için, spesifik olmayan bir hücre 14, T hücre canlılığı üzerindeki minimize zararlı etkiler ile 15 etiket ve 16 işlev görmektedir.

Bu protokol, ayrıca bir T hücre reseptörü (TCR) e özgü radyo-etiketli mAb kullanılarak hücre canlılığı ve işlevi üzerinde dezavantajlı etkileri azaltmak için bir yöntemi tarif etmektedir. İlk olarak, radyoizotop 64 Cu, inci ile mAb KJ1-26 konjüge üretimiE şelatör DOTA, ve daha sonra 64 Cu, radyo-etiketleme gösterilmiştir. İkinci bir aşamada, izolasyon ve DO11.10 donör farelerin cova-TH1 hücrelerinin genişlemesi ve 64Cu yüklü DOTA-konjuge mAb KJ1-26 (64Cu-DOTA-KJ1-26) ile radyo işaretli ayrıntılı olarak tarif edilmiştir. Uptake'leri ve bir doz kalibratörle radyoaktivite efflux sırasıyla y-sayımı ile değerlendirme, hem de IFN-y ELISA ile sunulmuştur tripan mavi dışlama ve işlevselliği ile hücre canlılığı üzerindeki 64Cu-radyoaktif etkilerinin değerlendirilmesi . In vivo hücre takibi yayılmayan için adoptif hücre transferi sonrası PET / CT tarafından cova kaynaklı akut solunum yolu DTHR ve görüntü elde olan bir fare modeli ortaya çıkarma açıklanmaktadır.

Ayrıca, bu markalama yaklaşım, farklı hastalık modellerinde farklı TCRler veya membrana bağlı reseptörlere veya ekspresyon mar ile ilgili genel hücreleri ile fare T hücreleri aktarılabilirkers sürekli zar 17 mekik yatan.

Protocol

Güvenlik önlemleri: radyoaktivite kullanırken, 2-inç kalınlığında kurşun tuğla arkasında 64 Cu depolamak ve aktivitesini taşıyan gemiler için ilgili ekranlama kullanın. dolaylı dolaysız el temasını önlemek ve radyoaktif madde maruziyeti en aza indirmek için korumasız kaynaklar işlemek için uygun araçları kullanın. Her zaman radyasyon dozimetre izleme rozetleri ve kişisel koruma ekipmanları giymek ve kendini kontrol ve kirlenme için çalışma alanı hemen ele almak. önce radyoak…

Representative Results

Şekil 1, 64, Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ve in vitro ve bu protokol kaplı vivo çalışmalarda deney tasarımı ile cova-TH1 hücrelerinin etiketlenmesi özetlemektedir. Şekil 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26 mAb Etiketleme Proses ve Deney Tasarımı. 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ile radyoaktif eti…

Discussion

Bu protokol, stabil bir şekilde PET in vivo izlenmesi için hücreler radyolabel güvenilir ve kolay bir yöntem sunulur. 64Cu-DOTA-KJ1-26-mAb ve homing ile de radyo-etiketlenebilir, cova-TH1 hücreleri, izole edilmiş ve donör farelerden in vitro olarak genişletilebilir, bu yöntem olabilir kullanan bir Cova sunum siteleri gibi pulmoner ve perithymic LN için takip edilmiştir akut solunum yolu DTHR cova kaynaklı.

çelatör mAb modifikasyonu hızlı ve verim…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar deneyleri ve veri analizi sırasında destek için Dr. Julia Mannheim Walter Ehrlichmann Ramona Stumm, Funda Cay Daniel Bukala, Maren Harant yanı sıra Natalie Altmeyer teşekkür ederim. Bu çalışma Werner Siemens-Vakfı, SFB685 aracılığıyla DFG (proje B6) ve fal (2309-0-0) tarafından desteklenmiştir.

Materials

HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber Ögussa Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 ml Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitro evaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

References

  1. Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson’s Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
  2. Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
  3. Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
  4. Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
  5. Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
  6. Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
  7. Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
  8. Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
  9. Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
  10. Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
  11. Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
  12. Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
  13. Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
  14. Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
  15. Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
  16. Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
  17. Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
  18. McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
  19. Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
  20. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, ., J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
  21. Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
  22. Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , 363-370 (2011).
  23. Phelps, M. E. . PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , 93-101 (2004).
  24. Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
  25. Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
  26. Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
  27. Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
  28. Johnson, T. E., Birky, B. K. . Health Physics and Radiological Health. , (2011).
  29. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).

Play Video

Cite This Article
Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

View Video