Summary

Murina de linfocitos Etiquetado por<sup> 64</sup> Cu-Anticuerpo objetivo de receptores de<em> En Vivo</em> Tráfico de células mediante PET / CT

Published: April 29, 2017
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Summary

Después de la preparación de un anticuerpo monoclonal modificado-Cu 64 la unión a un receptor de células T murino transgénico, las células T son radiomarcado in vivo, se analizaron para viabilidad, la funcionalidad, la estabilidad etiquetado y apoptosis, y adoptivamente transferidas en ratones con una vía aérea hipersensibilidad de tipo retardado reacción para formación de imágenes no invasiva mediante tomografía de emisión de positrones / tomografía computarizada (PET / CT).

Abstract

Este protocolo ilustra la producción de 64 Cu y el quelante de conjugación / radiomarcaje de un anticuerpo monoclonal (mAb), seguido de cultivo de células de linfocitos murinos y receptor 64 Cu-anticuerpo dirigido de las células. Evaluación in vitro de se describen el radiomarcador y no invasiva en el rastreo de células in vivo en un modelo animal de una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado de la vía aérea (DTHR) por PET / CT.

En detalle, se muestra la conjugación de un mAb con el quelante de ácido 1,4,7,10-tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA). Después de la producción de radioactivo 64 Cu, radiomarcaje del mAb DOTA-conjugado se describe. A continuación, la expansión de la ovoalbúmina de pollo (COVA) CD4 específica de + interferón (IFN) -γ productoras se representan las células T helper (cova-Th1) y el posterior radiomarcaje de las células cova-TH1. Diversas técnicas in vitro se presentan para evaluar la efefec- de 64 Cu-radiomarcaje en las células, tales como la determinación de la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano, la tinción para la apoptosis con Anexina V para citometría de flujo, y la evaluación de la funcionalidad mediante la enzima de ensayo inmunoabsorbente ligado a IFN-γ (ELISA) . Además, la determinación de la absorción radiactiva en las células y la estabilidad de etiquetado se describen en detalle. Este protocolo describe además cómo realizar estudios de seguimiento de células en un modelo animal para una DTHR las vías respiratorias y, por lo tanto, se incluye la inducción de la vía aérea DHTR aguda inducida por cova en ratones BALB / c. Por último, se presenta un robusto flujo de trabajo de PET / CT incluyendo la adquisición de imágenes, reconstrucción y análisis.

El enfoque dirigido a un receptor 64 Cu-anticuerpo con la subsiguiente internalización del receptor proporciona una alta especificidad y estabilidad, la reducción de la toxicidad celular, y las bajas tasas de flujo de salida en comparación con PET comunes trazadores para el etiquetado de células, por ejemplo 64 Cubis -pyruvaldehyde (N4-metiltiosemicarbazona) (64 Cu-PTSM). Por último, nuestro enfoque permite no invasivo en el seguimiento in vivo de células mediante PET / CT con una relación óptima de señal a fondo durante 48 h. Este enfoque experimental se puede transferir a diferentes modelos animales y tipos de células con receptores unidos a la membrana que se internalizan.

Introduction

Seguimiento de células no invasiva es una herramienta versátil para controlar la función celular, la migración y homing in vivo. Recientes estudios de seguimiento celular se han centrado en mesenquimales 1, 2 o de médula ósea las células madre derivadas de 3 en el contexto de la medicina regenerativa, las células blancas de la sangre periférica autólogas en la inflamación o linfocitos T en las terapias con células adoptivas contra el cáncer de 3, 4. La elucidación de los sitios de acción y los principios biológicos subyacentes de las terapias basadas en células es de tremenda importancia. Linfocitos T citotóxicos CD8 +, por ingeniería genética del receptor de antígeno quimérico (CAR) las células T o linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) fueron consideradas ampliamente como el estándar de oro. Sin embargo, las células TH1 específicos de antígeno asociado a tumores han demostrado ser una opción de tratamiento alternativa efectiva 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores clave en la inflamación, enfermedades autoinmunes específicas de órganos (por ejemplo, la artritis reumatoide o el asma bronquial), y células de gran interés en la inmunoterapia del cáncer, es importante para caracterizar los patrones de distribución y homing temporales de células TH1. No invasiva in vivo de formación de imágenes por PET presenta un método cuantitativo, altamente sensible 8 para examinar los patrones de migración de células, en homing vivo, y los sitios de acción y las respuestas de células T durante la inflamación, alergias, infecciones o el rechazo del tumor 9, 10, 11.

Clínicamente, 111 In-oxina se utiliza para la gammagrafía de leucocitos para la discriminación de la inflamación y la infección 12, mientras que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucosa (18 F-FDG) se utiliza comúnmente para estudios de seguimiento celular por PET 3, 13. Una desventaja importante de este trazador PET, sin embargo, es la corta vida media del radionúclido 18 F a 109,7 min y la baja estabilidad intracelular que impide de formación de imágenes en los puntos de tiempo posteriores poste de transferencia de células adoptivas. Para más largo plazo en los estudios de seguimiento de células in vivo por PET, aunque inestable en las células, 64 Cu-PTSM se utiliza con frecuencia para etiquetar de manera no específica las células 14, 15 con efectos perjudiciales minimizadas en la viabilidad de las células T y la función 16.

Este protocolo describe un método para reducir aún más efectos desventajosos sobre la viabilidad celular y la función utilizando un receptor de células T (TCR) mAb radiomarcado específico de. En primer lugar, la producción del radioisótopo 64 Cu, la conjugación del mAb KJ1-26 con ésimoe quelante DOTA, y la posterior 64 Cu-radiomarcaje se muestran. En una segunda etapa, el aislamiento y la expansión de las células cova-TH1 de ratones donantes DO11.10 y el radiomarcado con 64 cargado-Cu DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) se describen en detalle. La evaluación de los valores de captación y de flujo de salida de la radiactividad con un calibrador de dosis y por gamma-conteo, respectivamente, así como la evaluación de los efectos de 64 Cu-radiomarcaje sobre la viabilidad celular por exclusión de azul de tripano y la funcionalidad con se presentan IFN-gamma ELISA . Para no invasivo en el seguimiento de células in vivo, se describen la obtención de un modelo de ratón de inducida por COVA vías respiratorias aguda DTHR y Adquisición de imágenes por PET / CT después de la transferencia celular adoptiva.

Además, este enfoque de etiquetado puede ser transferido a diferentes modelos de enfermedad, las células T murinas con diferentes TCR o células generales de interés con los receptores unidos a la membrana o mar expresiónkers subyacente membrana continua shuttling 17.

Protocol

Precauciones de seguridad: Al manipular la radiactividad, almacenar 64 Cu detrás de ladrillos de plomo 2 pulgada de grosor y utilizar respectivo blindaje para todos los buques que llevan actividad. Utilizar las herramientas adecuadas para manejar indirectamente fuentes sin blindaje para evitar el contacto directo de las manos y reducir al mínimo la exposición a material radiactivo. Siempre use insignias de monitoreo dosimetría de radiación y equipo de protección personal y comprobar uno mismo y la zona …

Representative Results

La Figura 1 resume el etiquetado de las células cova-TH1 con el 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y el diseño experimental para la in vitro y en estudios in vivo cubiertos en este protocolo. Figura 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb proceso de etiquetado y Diseño Experimental. (A)</str…

Discussion

Este protocolo presenta un método fiable y fácil de marcar radiactivamente de forma estable células para el seguimiento in vivo mediante PET. Utilizando este método, las células cova-TH1, aislado y ampliado in vitro de ratones donantes, podría ser radiomarcados con 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb y su homing fue rastreado a la LNS pulmonares y peritímica como lugares de presentación COVA en una COVA inducida DTHR vías respiratorias aguda.

La modificación del mAb …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecen a la doctora Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, así como Natalie Altmeyer por el apoyo durante los experimentos y análisis de datos. Este trabajo fue apoyado por el Werner Siemens-Fundación, la DFG a través de la SFB685 (B6 proyecto) y la fortuna (2309-0-0).

Materials

HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber Ögussa Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 ml Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitro evaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

References

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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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