Summary

Murine lymphocytaire par étiquetage<sup> 64</sup> Cu-anticorps du récepteur de ciblage pour<em> In Vivo</em> Le trafic cellulaire par PET / CT

Published: April 29, 2017
doi:

Summary

Suite à la préparation d'un 64 anticorps monoclonal Cu-modifié de liaison à un récepteur de cellule T murine transgénique, les cellules T sont radiomarqué in vivo, une analyse de la viabilité, la fonctionnalité, la stabilité du marquage et de l' apoptose, et par transfert adoptif dans des souris avec une voie aérienne d'hypersensibilité de type retardé réaction pour l'imagerie non invasive par tomographie par émission de positons / tomodensitométrie (PET / CT).

Abstract

Ce protocole illustre la production de 64 Cu et la conjugaison chélateur / radiomarquage d'un anticorps monoclonal (mAb) , suivie d' une culture de cellules de lymphocytes murins et 64 récepteur Cu-anticorps ciblant des cellules. Dans l' évaluation in vitro du radiomarqueur et non-invasive dans le suivi des cellules in vivo dans un modèle animal d'une voie aérienne d' hypersensibilité retardée réaction (DTHR) par PET / CT sont décrites.

Dans le détail, la conjugaison d'un anticorps monoclonal avec l'agent chélatant acide 1,4,7,10-tétraazacyclododécane-1,4,7,10-tétraacétique (DOTA) est représenté. Suite à la production de 64 radioactif Cu, le radiomarquage de l'anticorps monoclonal DOTA-conjugué est décrite. Ensuite, l'expansion de l' ovalbumine de poulet (COVA) CD4 + interféron spécifique de (IFN) -γ-production de cellules T auxiliaires (Cova-TH1) et la radiomarquage subséquente des cellules Cova-TH1 sont représentés. Diverses techniques in vitro sont présentées pour évaluer l'effets de 64 Cu-radiomarquage sur les cellules, telles que la détermination de la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan, la coloration de l' apoptose avec l' Annexine V pour la cytométrie en flux, et l'évaluation de la fonctionnalité par un dosage immuno-enzymatique IFN-γ (ELISA) . En outre, la détermination de l'absorption radioactive dans les cellules et la stabilité de l'étiquetage sont décrites en détail. Ce protocole décrit en outre comment effectuer des études de suivi de cellules dans un modèle animal pour une DTHR des voies respiratoires et, par conséquent, l'induction de DHTR aiguë des voies aériennes induite par COVA dans des souris BALB / c est inclus. Enfin, un flux de travail TEP / CT robuste comprenant l'acquisition d'image, la reconstruction, et l'analyse est présentée.

Le 64 récepteur de Cu-anticorps approche de ciblage avec l' internalisation du récepteur ultérieur fournit une spécificité élevée et la stabilité, réduit la toxicité cellulaire, et de faibles taux d'efflux par rapport au PET traceurs communs pour le marquage cellulaire, par exemple 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-méthylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). Enfin, notre approche permet non-invasive in vivo suivi des cellules en PET / CT avec un rapport optimal signal-sur-fond pendant 48 heures. Cette approche expérimentale peut être transférée à différents modèles animaux et types de cellules avec les récepteurs liés à la membrane qui sont internalisés.

Introduction

Le suivi des cellules non-invasive est un outil polyvalent pour surveiller la fonction cellulaire, la migration et homing in vivo. De récentes études de suivi de cellules se sont concentrées sur mésenchymateuses 1, 2 ou cellules souches dérivées de la moelle osseuse 3 dans le cadre de la médecine régénérative, les globules blancs périphériques autologues dans l' inflammation ou des lymphocytes T dans des thérapies cellulaires adoptifs contre le cancer 3, 4. L'élucidation des sites d'action et les principes biologiques sous-jacents des thérapies à base de cellules est d'une importance énorme. CD8 + lymphocytes T cytotoxiques, récepteur de l' antigène chimère génétiquement modifiées (CAR) des cellules T ou des lymphocytes infiltrant les tumeurs (TIL) ont été largement considéré comme l'étalon-or. Cependant, les cellules TH1 spécifiques de l' antigène associé à la tumeur se sont révélés être une option de traitement alternative efficace 4, </ sup> 5, 6, 7.

Comme les principaux acteurs dans l' inflammation, les maladies auto – immunes spécifiques d'organes (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde ou d' asthme bronchique), et les cellules de grand intérêt pour l' immunothérapie du cancer, il est important de caractériser les modes de distribution et de homing temporelles des cellules TH1. L' imagerie in vivo non invasive par TEP présente une quantitative, une méthode très sensible 8 pour examiner les schémas de migration des cellules, dans la prise d' origine in vivo, et les sites d'action des lymphocytes T et des réponses au cours de l' inflammation, les allergies, les infections ou le rejet de la tumeur 9, 10, 11.

Cliniquement, 111 In-oxine est utilisé pour la scintigraphie des leucocytes pour la discrimination de l' inflammation et de l' infection 12, tandis que le 2-désoxy-2- (18F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) est couramment utilisé pour les études de suivi des cellules en PET 3, 13. Un inconvénient majeur de ce traceur PET, cependant, est la courte demi-vie du radionucléide 18 F à 109,7 min et la faible stabilité intracellulaire qui empêche l' imagerie aux points de temps plus tard transfert post cellulaire adoptive. Pour plus long terme in vivo des études de suivi de cellules par PET, bien instable dans les cellules, 64 Cu-PTSM est fréquemment utilisé pour étiqueter de façon non spécifique des cellules 14, 15 avec des effets néfastes réduits au minimum sur la viabilité des cellules T et la fonction 16.

Ce protocole décrit un procédé pour réduire davantage les effets désavantageux sur la viabilité cellulaire et la fonction à l'aide d'un récepteur de cellule T (TCR) de mAb radiomarquée spécifique de. Premièrement, la production du radio – isotope 64 Cu, la conjugaison du mAb avec KJ1-26 ee chélateur DOTA, et le 64 Cu-radiomarquage ultérieur sont présentés. Dans une deuxième étape, l'isolement et l' expansion de cellules Cova-TH1 de souris donneuses DO11.10 et le radiomarquage avec sont décrits en détail 64 mAb conjugué DOTA-Cu chargé KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26). L'évaluation des valeurs absorption et l' efflux de la radioactivité avec un calibrateur de dose et par y-comptage, respectivement, ainsi que l'évaluation des effets de 64 Cu-radiomarquage sur la viabilité des cellules par exclusion au bleu trypan et de fonctionnalité avec ELISA de IFN-y sont présentés . Pour les non-invasive dans le suivi des cellules in vivo, le déclenchement d'un modèle de souris de DTHR voies aériennes aiguë induite par Cova et l' acquisition d' image par PET / CT après le transfert cellulaire adoptive sont décrits.

De plus, cette approche de l'étiquetage peut être transférée à différents modèles de la maladie, les cellules T de souris avec différentes cellules ou RLT d'intérêt général avec les récepteurs liés à la membrane ou l'expression markers membrane continue qui sous – tend la navette 17.

Protocol

Mesures de sécurité: Lors de la manipulation de radioactivité, stocker 64 Cu derrière plomb de 2 pouces d'épaisseur des briques et utiliser un blindage respectif pour tous les navires transportant l' activité. Utiliser des outils appropriés pour gérer indirectement des sources non protégées pour éviter le contact direct des mains et de minimiser l'exposition aux matières radioactives. Portez toujours des badges de surveillance dosimétrique de rayonnement et de l'équipement de pro…

Representative Results

La figure 1 résume le marquage des cellules Cova-TH1 avec le 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et la conception expérimentale pour l'in vitro et in vivo traitées dans ce protocole. Figure 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb étiquetage Process & Experimental design. (A) Représe…

Discussion

Ce protocole présente une méthode fiable et facile à radiomarquer de manière stable des cellules pour le suivi in vivo par TEP. En utilisant cette méthode, les cellules Cova-TH1, isolé et élargi in vitro à partir de souris donneuses, pourrait être radiomarqués avec 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb et leur prise d' origine a été suivi pour les ganglions pulmonaires et périthymique en tant que sites de présentation dans une Cova Cova induite par DTHR des voies aériennes aiguës.

<p…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient le Dr Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant ainsi que Natalie Altmeyer pour le soutien lors de l'analyse des expériences et des données. Ce travail a été soutenu par Werner Siemens-Fondation, la DFG par le SFB685 (projet B6) et FORTUNE (2309-0-0).

Materials

HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber Ögussa Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 ml Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitro evaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

References

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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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