Murine לימפוציטים תיוג ידי<sup> 64</sup> Cu-נוגדן קולטן מיקוד עבור<em> In vivo</em> סחר Cell על ידי PET / CT
Summary
בעקבות הכנת נוגדן חד-שבטי-modified Cu 64 מחייב לקולטן תא T בעכברים טרנסגניים, תאי T הם רדיואקטיבי in vivo, ניתח עבור כדאיות, פונקציונליות, יציבות תיוג אפופטוזיס, והועברו adoptively לעכברים עם דרכי הנשימה מתעכב מסוג רגישות יתר תגובה עבור הדמיה לא פולשנית של טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים / טומוגרפיה ממוחשבת (PET / CT).
Abstract
פרוטוקול זה ממחיש את הייצור של 64 Cu ואת radiolabeling נטיה / chelator של נוגדנים חד שבטיים (מב) ואחריו תרבית תאים לימפוציטים בעכברים ו 64 Cu-נוגדן לקולטן מיקוד של תאים. בהערכה במבחנה של radiolabel ולא פולשנית ב מעקב תא vivo במודל חיה של תגובת רגישות יתר בדרכי נשימה מתעכב-סוג (DTHR) על ידי PET / CT מתוארים.
בפירוט, הנטייה של מב עם חומצת 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic chelator (DOTA) מוצגת. בעקבות ייצור של 64 Cu רדיואקטיבי, radiolabeling של מב DOTA מצומדות מתואר. הבא, הרחבת ovalbumin עוף (Cova) -specific CD4 + אינטרפרון (IFN) -γ-ייצור תאי T מסייעים (Cova-TH1) ואת radiolabeling עוקבות של תאים Cova-TH1 מתוארים. טכניקות שונות במבחנה ב מוצגות להעריך את EFfects של 64 Cu-radiolabeling על תאים, כגון קביעת כדאיות התא על ידי הרחקה trypan כחול, מכתים עבור אפופטוזיס עם Annexin V עבור זרימת cytometry, ואת ההערכה של פונקציונליות ידי IFN-γ assay immunosorbent enzyme-linked (ELISA) . יתר על כן, קביעת ספיגת רדיואקטיבי לתוך התאים ואת יציבות התיוג מתוארת בפירוט. פרוטוקול זה ממשיך ומתאר כיצד לבצע מחקרי מעקב תא במודל חיה במשך DTHR דרכי נשימה, ולכן, בדומה להשפעה DHTR בדרכי נשימה חריפה הנגרמת Cova בעכברי BALB / ג כלולה. לבסוף, זרימת עבודת PET / CT חזקה כולל רכישת תמונה, שחזור וניתוח מוצגת.
64 גישת מיקוד קולטן Cu-הנוגדן עם הפנמת קולטן עוקבת מספקת סגולית ויציבות גבוהות, רעילויות הסלולר מופחתות, ושיעורים בזרימה נמוכים לעומת PET-קליעים נותבים משותפים תיוג תא, למשל 64 CuBIS -pyruvaldehyde (N4-methylthiosemicarbazone) (64 Cu-PTSM). לבסוף, הגישה שלנו מאפשרת לא פולשנית למעקב תא vivo על ידי PET / CT עם יחס אות-רקע אופטימלי עבור 48 h. גישה ניסיונית זו ניתן להעביר מודלים שונים של בעלי חיים סוגי תאים עם קולטני קרום הנכנס כי הן הפנימו.
Introduction
מעקב תא לא פולשני הוא כלי תכליתי כדי לפקח תא פונקציה, גירת ביות in vivo. מחקרי מעקב תא שנעשה לאחרונה התמקדו המזנכימה 1, 2 או תאי גזע שמקורם במוח עצם 3 בהקשר של רפואת רגנרטיבית, תאי דם לבנים היקפיים עצמיים דלקת או לימפוציטים מסוג T ב טיפולים בתאי מאמצת נגד סרטן 3, 4. וביאור באתרי הפעולה ואת העקרונות הביולוגיים הבסיסיים של טיפולים מבוססי תאי היא בעלת חשיבות עצומה. לימפוציטים CD8 + T ציטוטוקסיים, מהונדסים גנטיים הקולטן לאנטיגן כימרי (CAR) תאי T או לימפוציטים שחדר-גידול (TILs) נחשבו נרחב כתקן הזהב. עם זאת, אנטיגן ספציפי הקשור לגידול תא TH1 שהוכח מהווה טיפול אלטרנטיבי יעיל 4, </ sup> 5, 6, 7.
כמו שחקני מפתח דלקת, מחלות אוטואימוניות ספציפי איבר (למשל, דלקת מפרקים שגרוניות או אסטמה), ותאים של ריבית גבוהה חיסוני סרטן, חשוב לאפיין את דפוסי הפצת ביות הזמניים של תאי TH1. הדמיה לא פולשנית in vivo על ידי PET מציגה שיטה כמותית, רגישה מאוד 8 לבחון דפוסי נדידת תאים, ב ביות vivo, וכן באתרי פעולת תא T ותגובות בזמן דלקת, אלרגיות, דלקות או גידולי דחייה 9, 10, 11.
מבחינה קלינית, 111 ב-oxine משמש scintigraphy לויקוציטים עבור אפליה של דלקת וזיהום 12, תוך 2-deoxy-2- (18F) fluoro-D-גלוקוז (18 F-FDG) הוא נפוץ ללימודי מעקב התא על ידי 3 PET, 13. חסרון עיקרי אחד נותב PET הזה, לעומת זאת, הוא זמן מחצית החיים הקצר של 18 F רדיונוקלידית ב 109.7 דקות ואת היציבות התאית הנמוכה המונעת הדמיה בנקודות זמן מאוחר לפרסם העברת תא מאמצת. עבור לטווח ארוך יותר במחקרי מעקב תא vivo על ידי PET, למרות יציבה בתאים, 64 Cu-PTSM משמש לעתים קרובות כדי לתייג nonspecifically תאים 14, 15 עם השפעות מזיקות ממוזערות על כדאיויות תא T ולתפקד 16.
פרוטוקול זה מתאר שיטה נוספת להפחית תופעות נחות על כדאיות התא ומתפקדים באמצעות קולטן תא T (TCR) מב רדיואקטיבי -specific. ראשית, הייצור של Cu 64 רדיואיזוטופיים, הנטייה של KJ1-26 מב עם הדואר chelator DOTA, ואת radiolabeling Cu-64 העוקבות מוצגות. בשלב שני, הבידוד הרחב של תאי Cova-TH1 של עכברים תורמים DO11.10 ואת radiolabeling עם 64 Cu-טעון DOTA מצומדות מב KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) מתוארים בפירוט. ההערכה של ערכים ספיגים בזרימה של רדיואקטיביות עם כיל מינון ועל ידי γ-ספירה, בהתאמה, כמו גם את הערכה של ההשפעות של 64 Cu-radiolabeling על כדאיויות תא על ידי הרחקת trypan כחולה ופונקציונלי עם IFN-γ ELISA מוצג . עבור לא פולשנית למעקב תא vivo, ההתמחרות של מודל עכבר של רכישת תמונת DTHR בדרכי נשימה חריפה הנגרמת Cova ידי PET / CT לאחר העברת תא מאמצת מתוארת.
יתר על כן, גישת תיוג זו ניתן להעביר מודלים למחלות שונים, תאי T בעכברים עם TCRs שונה או תאים בכלל עניין עם קולטנים או mar ביטוי קרום הנכנסKERS שבבסיס קרום רציף shuttling 17.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מציג שיטה אמינה וקלה radiolabel תאים ביציבות למעקב in vivo על ידי PET. ניצול שיטה זו, תאי Cova-TH1, מבודד והרחיב במבחנה מעכברים התורם, יכול להיות רדיואקטיבי עם 64 Cu-DOTA-KJ1-26-מב ו הביות שלהם היה במעקב של LNs ריאתי perithymic כאתרים של המצגת Cova בתוך Cova מושרה DTHR בדרכי נ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים ד"ר ג'וליה מנהיים, וולטר Ehrlichmann, רמונה Stumm, Funda קיי, דניאל Bukala, מארן Harant כמו גם נטלי Altmeyer על התמיכה במהלך ניתוח ניסויים ונתונים. עבודה זו נתמכה על ידי ורנר סימנס-קרן, DFG דרך SFB685 (פרויקט B6) ומזל (2309-0-0).
Materials
| HCl, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.00318 | 64Cu production |
| Methanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.06007 | 64Cu production |
| Isopropanol, Suprapur | Merck, Darmstadt, Germany | 1.0104 | 64Cu production |
| Pt/Ir (90/10) plate | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| PEEK chamber | Ögussa | Custom made | 64Cu production |
| 64Ni | Chemotrade | 64Cu production | |
| Polygram SIL G/UV 254 plate | Macherey-Nagel | 805021 | 64Cu production |
| Ion exchange column | BioRad | AG1-X8 | 64Cu production |
| Solid state target system for PETtrace | WKL | costum made | 64Cu production |
| 64Cu work-up module | WKL | costum made | 64Cu production |
| Dose calibrator | Capintec | CRC-25R | |
| PETtrace cyclotron | General Electric Medical Systems | ||
| DOTA-NHS | Macrocyclics | B-280 | DOTA-conjugation |
| Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) | Isolated from hybridoma cell culture | DOTA-conjugation | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | 71633 | DOTA-conjugation |
| H+ Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | DOTA-conjugation |
| Amicon Ultra-15 filter unit | Merck Millipore | UFC910008 | DOTA-conjugation |
| Rotipuran ultrapure water | Carl Roth | HN68.3 | DOTA-conjugation |
| Ammonium acetate | Sigma-Aldrich | 32301 | DOTA-conjugation |
| PBS | University Tuebingen | DOTA-conjugation | |
| Micro Bio-spin P-6 column | Bio-Rad Laboratories | 7326221 | DOTA-conjugation |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | 71497 | DOTA-conjugation |
| Cyclone Plus PhosphorImager | Perkin-Elmer | L2250116 | DOTA-conjugation |
| DMEM | Merck Millipore | 102568 | ingredient for T cell medium |
| FCS | Merck Millipore | S0115/1004B | ingredient for T cell medium |
| Sodium pyruvate | Merck Millipore | L0473 | ingredient for T cell medium |
| MEM-amino acids | Merck Millipore | K0293 | ingredient for T cell medium |
| HEPES | Merck Millipore | L 1613 | ingredient for T cell medium |
| Penicillin/Streptomycin | Merck Millipore | A2212 | ingredient for T cell medium |
| 0.05 mM 2-β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | ingredient for T cell medium |
| DO11.10 mice | in-house breeding | TH1 cell culture | |
| DPBS | Gibco | 14190144 | TH1 cell culture |
| Cell strainer 40 µm | Corning | 352340 | TH1 cell culture |
| ACK Lysing Buffer | Lonza | 10-548E | TH1 cell culture |
| CD4 MicroBeads, mouse | Miltenyi Biotech | 130-097-145 | TH1 cell culture |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotech | 130-090-976 | TH1 cell culture |
| LS column | Miltenyi Biotech | 130-042-401 | TH1 cell culture |
| anti-CD4 antibody (Gk1.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| anti-CD8 antibody (5367.2) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Anti-rat antibody (MAR18.5) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| Rabbit complement MA | tebu-Bio | CL3221 | TH1 cell culture |
| Anti-IL-4 antibody (11B11) | Isolated from hybridoma cell culture | TH1 cell culture | |
| cOVA 323-339-peptide | EMC-micro-collections | Custom order | TH1 cell culture |
| CPG1668-oligonucleotides | Eurofins MWG Operon | Custom order | TH1 cell culture |
| IL-2 | Novartis | 65483-116-07 | TH1 cell culture |
| 96-well plates | Greiner | 655180 | TH1 cell culture |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | TH1 cell culture |
| cell culture flask | Greiner | 660175 | TH1 cell culture |
| 48-well plates | Greiner | 677 180 | cell labeling |
| Gammacell 1000 | Best Theratronics | via inquiry | |
| Gulmay RT225 | Gulmay | via inquiry | |
| Trypan blue | Merck Millipore | L6323 | in vitro evaluation |
| Mouse IFN-γ ELISA | BD Biosciences | 558258 | in vitro evaluation |
| PE Annexin V Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 559763 | in vitro evaluation |
| Tube 5 ml | Sarstedt | 55.476 | in vitro evaluation |
| Round-bottom tubes | BD Biosciences | 352008 | in vitro evaluation |
| Wizard γ-counter | Perkin-Elmer | 2480-0010 | in vitro evaluation |
| ELISA Reader MultiscanEX | Thermo Fisher Scientific | 51118177 | in vitro evaluation |
| Microscope | Leica | via inquiry | in vitro evaluation |
| BD LSRII | BD Biosciences | via inquiry | in vitro evaluation |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | in vivo cell trafficking |
| Aluminum gel | Serva Electrophoresis | 12261.01 | in vivo cell trafficking |
| Xylazine | Bayer HealthCare | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Ketamine | Ratiopharm | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| Isoflurane | CP-Pharma | Ordered via University hospital | in vivo cell trafficking |
| 30G needle | BD Biosciences | 304000 | in vivo cell trafficking |
| Syringe | BD Biosciences | 11612491 | in vivo cell trafficking |
| Capillaries 10 µl | VWR | 612-2439 | |
| Inveon PET scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso |
| Inveon SPECT/CT scanner | Siemens Healthineers | no longer available | in vivo cell trafficking |
| Inveon Research Workplace | Siemens Healthineers | image analysis, alternative software: Pmod |
References
- Cerri, S., et al. Intracarotid Infusion of Mesenchymal Stem Cells in an Animal Model of Parkinson’s Disease, Focusing on Cell Distribution and Neuroprotective and Behavioral Effects. Stem Cells Trans Med. 4 (9), 1073-1085 (2015).
- Hasenbach, K., et al. Monitoring the glioma tropism of bone marrow-derived progenitor cells by 2-photon laser scanning microscopy and positron emission tomography. Neuro Oncol. 14 (4), 471-481 (2012).
- Sood, V., et al. Biodistribution of 18F-FDG-Labeled Autologous Bone Marrow – Derived Stem Cells in Patients With Type 2 Diabetes Mellitus. Clin Nucl Med. 40 (9), 697-700 (2015).
- Perez-Diez, A., et al. CD4 cells can be more efficient at tumor rejection than CD8 cells. Blood. 109 (12), 5346-5354 (2007).
- Muranski, P., Restifo, N. P. Adoptive immunotherapy of cancer using CD4+ T cells. Curr. Opin. Immunol. 21 (2), 200-208 (2009).
- Braumuller, H., et al. T-helper-1-cell cytokines drive cancer into senescence. Nature. 494 (7437), 361-365 (2013).
- Kochenderfer, J. N., et al. Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19. Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).
- Cherry, S. R. Fundamentals of Positron Emission Tomography and Applications in Preclinical Drug Development. J. Clin. Pharmacol. 41 (5), 482-491 (2001).
- Tavaré, R., et al. An Effective Immuno-PET Imaging Method to Monitor CD8-Dependent Responses to Immunotherapy. Cancer Res. 76 (1), 73-82 (2016).
- Tavaré, R., et al. Engineered antibody fragments for immuno-PET imaging of endogenous CD8+ T cells in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111 (3), 1108-1113 (2014).
- Dobrenkov, K., et al. Monitoring the Efficacy of Adoptively Transferred Prostate Cancer-Targeted Human T Lymphocytes with PET and Bioluminescence Imaging. J Nucl Med. 49 (7), 1162-1170 (2008).
- Rini, J. N., et al. PET with FDG-labeled Leukocytes versus Scintigraphy with 111In-Oxine-labeled Leukocytes for Detection of Infection. Radiology. 238 (3), 978-987 (2006).
- Ritchie, D., et al. In vivo tracking of macrophage activated killer cells to sites of metastatic ovarian carcinoma. Cancer Immunol. Immunother. 56 (2), 155-163 (2006).
- Adonai, N., et al. Ex vivo cell labeling with 64Cu-pyruvaldehyde-bis(N4-methylthiosemicarbazone) for imaging cell trafficking in mice with positron-emission tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (5), 3030-3035 (2002).
- Huang, J., Lee, C. C. I., Sutcliffe, J. L., Cherry, S. R., Tarantal, A. F. Radiolabeling Rhesus Monkey CD34+ Hematopoietic and Mesenchymal Stem Cells with 64Cu-Pyruvaldehyde-Bis(N4-Methylthiosemicarbazone) for MicroPET Imaging. Mol. Imaging. 7 (1), (2008).
- Griessinger, C. M., et al. In Vivo Tracking of Th1 Cells by PET Reveals Quantitative and Temporal Distribution and Specific Homing in Lymphatic Tissue. J Nucl Med. 55 (2), 301-307 (2014).
- Griessinger, C. M., et al. 64Cu antibody-targeting of the T-cell receptor and subsequent internalization enables in vivo tracking of lymphocytes by PET. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (4), 1161-1166 (2015).
- McCarthy, D. W., et al. Efficient production of high specific activity 64Cu using a biomedical cyclotron. Nucl. Med. Biol. 24 (1), 35-43 (1997).
- Kalkhof, S., Sinz, A. Chances and pitfalls of chemical cross-linking with amine-reactive N-hydroxysuccinimide esters. Anal. Bioanal. Chem. 392 (1), 305-312 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, ., J, Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. J Vis Exp. (79), e50765 (2013).
- Flaherty, S., Reynolds, J. M. Mouse Naive CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets. J Vis Exp. (98), e52739 (2015).
- Judenhofer, M., Wiehr, S., Kukuk, D., Fischer, K., Pichler, B. Chapter 363. Small Animal Imaging. Basics and Practical Guide. , 363-370 (2011).
- Phelps, M. E. . PET. Molecular Imaging and Its Biological Applications. , 93-101 (2004).
- Wu, A. M. Antibodies and Antimatter: The Resurgence of Immuno-PET. JNM. 50 (1), 2-5 (2009).
- Lewis, M. R., et al. In vivo evaluation of pretargeted 64Cu for tumor imaging and therapy. J Nucl Med. 44 (8), 1284-1292 (2003).
- Boswell, C. A., et al. Comparative in vivo stability of copper-64-labeled cross-bridged and conventional tetraazamacrocyclic complexes. J Med Chem. 47 (6), 1465-1474 (2004).
- Ghosh, S. C., et al. Comparison of DOTA and NODAGA as chelators for (64)Cu-labeled immunoconjugates. Nucl Med Biol. 42 (2), 177-183 (2015).
- Johnson, T. E., Birky, B. K. . Health Physics and Radiological Health. , (2011).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Meth. 2 (12), 932-940 (2005).
