Summary

Murine Lymphocyte Kennzeichnung von<sup> 64</sup> Cu-Antikörper-Rezeptor-Targeting für<em> In Vivo</em> Zellhandel von PET / CT

Published: April 29, 2017
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Summary

Nach der Herstellung eines 64 Cu-modifizierte monoklonale Antikörperbindung an einem transgenen Maus – T – Zell – Rezeptor, sind T – Zellen radioaktiv markiert in vivo, analysiert auf ihre Lebensfähigkeit, Funktionalität, Etikettieren Stabilität und Apoptose und adoptiv transferiert in Mäuse mit einem Atemweg Allergien vom verzögerten Typ Reaktion zur nichtinvasiven Bildgebung durch Positronen-Emissions-Tomographie / Computertomographie (PET / CT).

Abstract

Dieses Protokoll stellt die Herstellung von 64 Cu und die Chelator Konjugation / radioaktive Markierung eines monoklonalen Antikörpers (mAb) , gefolgt von murine Lymphozyten – Zellkultur und 64 Cu-Antikörper – Rezeptor der Zellen abzielen. Invitro – Bewertung der radioaktive Markierung und nicht-invasiven in vivo – Zellverfolgung in einem Tiermodell einer Atemwegs verzögerten Typ Überempfindlichkeitsreaktion (DTHR) von PET / CT beschrieben.

Im Detail wird die Konjugation eines mAb mit dem Chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) gezeigt. Nach der Herstellung von radioaktivem 64 Cu, radioaktiver Markierung der DOTA-konjugierten mAb beschrieben. Als nächstes werden die Erweiterung der Hühnerovalbumin (COVA) -spezifische CD4 + Interferon (IFN) -γ-produzierende T – Helferzellen (COVA-TH1) und die anschließende radioaktive Markierung der Cova-TH1 – Zellen dargestellt. Verschiedene in vitro – Techniken werden zur Veranschaulichung der ef auszuwertenkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf den Zellen, wie die Bestimmung der Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluß, die Färbung auf Apoptose mit Annexin V für die Durchflusszytometrie und die Beurteilung der Funktionalität , die durch IFN-γ enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Darüber hinaus ist die Bestimmung der radioaktiven Aufnahme in die Zellen und die Markierungsstabilität im Detail beschrieben. Dieses Protokoll weiter beschrieben, wie Zell Tracking-Studien in einem Tiermodell für einen Atemweg DTHR und daher durchzuführen, die Induktion von COVA-induziertem akuten Atemweg DHTR in BALB / c-Mäusen ist enthalten. Schließlich ist eine robuste PET / CT-Workflow inklusive Bildaufnahme, Rekonstruktion und Analyse vorgestellt.

Der Cu-64 – Antikörper – Rezeptor – Targeting – Ansatz mit nachfolgender Rezeptor – Internalisierung hohe Spezifität und Stabilität, reduzierte zelluläre Toxizität bereitstellt, und niedrigen Efflux Raten im Vergleich zu herkömmlichem PET-Tracer für die Markierung von Zellen, beispielsweise 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N4-methylthiosemicarbazon) (64-PTSM Cu). Schließlich ermöglicht unser Ansatz nicht-invasive in vivo Zellverfolgung durch PET / CT mit einem optimalen Signal-Rausch – Verhältnis für 48 Stunden. Dieser experimentelle Ansatz kann auf verschiedenen Tiermodellen und Zelltypen mit membrangebundenen Rezeptoren übertragen werden, die internalisiert werden.

Introduction

Nicht-invasive Zellverfolgung ist ein vielseitiges Werkzeug , Zellfunktion, Migration und Homing in vivo zu überwachen. Recent Zellverfolgung Studien haben sich auf mesenchymale 1, 2 oder Knochenmark stammende Stammzellen 3 im Rahmen der regenerativen Medizin, autologem peripherer weißer Blutzellen in einer Entzündung oder T – Lymphozyten in adoptiven Zelltherapien gegen Krebs 3, 4 konzentriert. Die Aufklärung der Wirkorte und die zugrunde liegenden biologischen Prinzipien der zellbasierten Therapien ist von großer Bedeutung. CD8 + zytotoxische T – Lymphozyten, genetisch chimäres Antigen – Rezeptor (CAR) oder T – Zellen tumorinfiltrierende Lymphocyten engineered (TILs) wurden in großem Umfang als der Goldstandard. Allerdings Tumor-assoziiertes Antigen-spezifische TH1 – Zellen haben sich als eine wirksame alternative Behandlungsoption 4, sein </ sup> 5, 6, 7.

Als wichtige Akteure bei der Entzündung, organspezifischen Autoimmunerkrankungen (zB rheumatoide Arthritis oder Asthma bronchiales), und Zellen von großen Interesse in der Krebsimmuntherapie, ist es wichtig , die zeitliche Verteilung und Referenzierung Muster von TH1 – Zellen zu charakterisieren. Nicht – invasive invivo – Bildgebung durch PET stellt eine quantitative, hochempfindliche Methode 8 Zellmigrationsmuster, in vivo Referenzierung und die Seiten der T – Zell – Antworten und die Aktion während der Entzündung, Allergien, Infektionen oder Tumorabstoßungs 9, 10, 11 zu untersuchen.

Klinisch 111 In-Oxin ist für Leukozyten – Szintigraphie für die Unterscheidung von Entzündung und Infektion 12, während 2-deoxy-2- (18 verwendet ,F) fluoro-D-glucose (18 F-FDG) wird für die Zell Tracking – Studien von PET 3, 13 verwendet. Ein wesentlicher Nachteil dieses PET – Tracer, jedoch ist die kurze Halbwertszeit des Radionuklide 18 F bei 109,7 min und der niedrigen intrazelluläre Stabilität , die Bildübertragung zu späteren Zeitpunkt nach der Adoptivzelle behindert. Für längerfristige invivo – Studien Zellverfolgung von PET, obwohl instabil in den Zellen, 64 Cu-PTSM häufig unspezifisch eingesetzt zu etikettieren Zellen 14, 15 mit minimierten nachteiligen Wirkungen auf T – Zell – Lebensfähigkeit und Funktion 16.

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur weiteren nachteiligen Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen zu reduzieren und die Funktion eines T-Zell-Rezeptor (TCR) -spezifischen radiomarkierten mAb verwendet. Zunächst wird die Herstellung der Radioisotop 64 Cu, die Konjugation des mAb KJ1-26 mit the Chelator DOTA und die nachfolgenden 64 Cu-Radiomarkierungs gezeigt. In einem zweiten Schritt wird die Isolierung und Expansion von COVA TH1-Zellen von DO11.10 Spendermäusen und die radioaktive Markierung mit 64 Cu belasteten DOTA-konjugierten mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) werden im Detail beschrieben. Die Beurteilung der Aufnahmewerte und Ausströmen von Radioaktivität mit einem Dosiskalibrator und y-Zählung jeweils sowie die Bewertung der Wirkungen von 64 Cu-Radiomarkierungs auf die Lebensfähigkeit der Zellen durch Trypanblau-Ausschluss und Funktionalität mit IFN- & gamma; ELISA vorgestellt . Für nicht-invasive in vivo – Zellverfolgung, das Hervorrufen von einem Maus – Modell von COVA-induzierter akuten Atemweg DTHR und Bildaufnahme von PET / CT nach dem adoptiven Zelltransfer beschrieben.

Darüber hinaus kann diese Kennzeichnung Ansatz zu verschiedenen Krankheitsmodellen, Maus-T-Zellen mit unterschiedlichen TCRs oder allgemeinen Zellen von Interesse mit membrangebundenen Rezeptoren oder Ausdruck mar übertragen werdenkers kontinuierlichen Membran Basiswert 17 pendelt.

Protocol

Sicherheitshinweise: Bei der Radioaktivität Handhabung speichern 64 Cu hinter 2-Zoll dicken Bleiziegel und verwenden entsprechende Abschirmung für alle Schiffe , die Aktivität. Verwenden Sie geeignete Werkzeuge, um indirekt ungeschirmte Quellen verarbeiten zu direkten Handkontakt zu vermeiden und minimieren Exposition gegenüber radioaktivem Material. Tragen Sie immer Strahlendosimetrie Überwachung Abzeichen und persönliche Schutzausrüstung und prüfen Sie sich selbst und der Arbeitsbereich für Kontami…

Representative Results

Abbildung 1 fasst die Etikettierung von COVA TH1-Zellen mit dem 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und der Versuchsplan für die in – vitro- und in – vivo – Studien in diesem Protokoll. Abbildung 1: 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb Etikettiervorgang & Experimentelles Design. <strong…

Discussion

Dieses Protokoll stellt eine zuverlässige und einfache Methode zum stabilen Zellen für in vivo – Tracking von PET radioaktive Markierung. Unter Verwendung dieses Verfahrens COVA-TH1 – Zellen, isoliert und in vitro aus Spendermäusen erweitert, könnte mit 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb und dessen homing wurde in einem die pulmonalen und perithymic LNs als Gebiete von COVA Präsentation nachgeführt radiomarkiert wird COVA-induzierten akuten Atemweg DTHR.

Die Modifikatio…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant sowie Natalie Altmeyer für die Unterstützung während der Experimente und Datenanalyse. Diese Arbeit wurde von der Werner Siemens-Stiftung, die DFG durch den SFB685 (Projekt B6) und Fortuné (2309-0-0) unterstützt.

Materials

HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber Ögussa Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 ml Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitro evaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

References

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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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