Summary

Murino Linfócitos Rotulagem por<sup> 64</sup> Cu-Antibody Receptor Segmentação para<em> In Vivo</em> Tráfico celular por PET / CT

Published: April 29, 2017
doi:

Summary

Seguindo a preparação de um anticorpo monoclonal 64 Cu-modificados se ligar a um receptor de células T de murino transgico, as células T são radiomarcados in vivo, analisadas para a viabilidade, funcionalidade, estabilidade rotulagem e apoptose, e transferidas adoptivamente para ratinhos com uma via aérea hipersensibilidade de tipo retardado reacção para imagem não invasivo por tomografia de emissão de positrões / tomografia computadorizada (PET / CT).

Abstract

Este protocolo ilustra a produção de 64 Cu e o quelante de conjugao / radiomarcação de um anticorpo monoclonal (mAb), seguido por cultura de células de linfócitos de murídeo e o receptor 64 de Cu-anticorpo segmentação das células. Avaliação in vitro do marcador radioactivo e não-invasivo de rastreamento de células in vivo num modelo animal de uma via respiratória de tipo retardado de reacção de hipersensibilidade (DTHR) por PET / CT são descritos.

Em detalhe, a conjugação de um mAb com o quelante de ácido 1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-1,4,7,10-tetra-acético (DOTA) é mostrado. Após a produção de 64 Cu radioactivos, marcação radioactiva do mAb DOTA-conjugado é descrito. Em seguida, a expansão de ovalbumina de galinha (Cova) CD4 + espec�ico interferão (IFN) -γ produtoras de células T auxiliares (Cova-TH1) e a radiomarcação subsequente das células Cova-TH1 estão representados. Várias técnicas in vitro são apresentados para avaliar a effects de 64 Cu-radiomarcao sobre as células, tais como a determinação da viabilidade das células por exclusão do azul de tripano, a coloração para a apoptose com anexina V por citometria de fluxo, e a avaliação da funcionalidade por ensaio imunossorvente ligado a enzima de IFN-γ (ELISA) . Além disso, a determinação da incorporação radioactiva nas células e a estabilidade de marcação são descritos em detalhe. Este protocolo descreve ainda como realizar os estudos de seguimento de células em um modelo animal para uma DTHR das vias respiratórias e, por conseguinte, a indução de-induzida das vias respiratórias Cova DHTR aguda em ratinhos BALB / c está incluído. Finalmente, um fluxo de trabalho / CT robusta PET incluindo aquisição de imagem, reconstrução e análise é apresentada.

A abordagem de direccionamento do receptor 64 de Cu-anticorpo com a internalização do receptor subsequente proporciona uma elevada especificidade e estabilidade, reduzida toxicidade celular, e as taxas de efluxo baixos em comparação com PET-traçadores comuns para marcação celular, por exemplo, 64 Cu-pyruvaldehyde bis (N-4-metiltio-semicarbazona) (64 Cu-PTSM). Finalmente, a nossa abordagem permite não invasiva no rastreamento de células in vivo por PET / CT com uma óptima relação sinal-para-fundo durante 48 h. Esta abordagem experimental pode ser transferido para modelos animais e tipos de células diferentes com receptores ligados a membranas que são internalizados.

Introduction

Rastreamento de células não-invasiva é um instrumento versátil para monitorizar a função celular, migração e homing in vivo. Estudos recentes de rastreamento de células têm-se centrado no mesenquimais 1, 2 ou da medula óssea derivadas de células estaminais 3 no contexto da medicina regenerativa, as células brancas do sangue perifico autogos em inflamação ou linfócitos T em terapias de células adoptivas contra cancro de 3, 4. A elucidação dos locais de acção e os princípios subjacentes biológicos de terapias à base de células é de grande importância. Linfócitos T citotóxicos CD8 +, por engenharia genética do receptor de antigénio quimérico (CAR) células T ou linfócitos que se infiltram no tumor (TIL) foram amplamente considerada como o padrão de ouro. No entanto, as células TH1 específicas para o antigénio associado a tumores provaram ser uma alternativa eficaz opção de tratamento 4, </ sup> 5, 6, 7.

Como actores-chave na inflamação, as doenças auto-imunes específicas de órgãos (por exemplo, artrite reumatóide ou asma brônquica), e células de elevado interesse em imunoterapia do cancro, é importante caracterizar a distribuição e homing padrões temporais de células TH1. Não invasiva in vivo de imagiologia por PET apresenta, um método altamente sensível quantitativa 8 para analisar os padrões de migração celular, no retorno in vivo, e os sítios de acção de células T e respostas durante a inflamao, alergias, infecções ou de rejeição de tumor 9, 10, 11.

Clinicamente, 111In-oxina é usado para cintigrafia de leucócitos para a discriminação de inflamação e infecção de 12, enquanto que 2-desoxi-2- (18F) fluoro-D-glucose (18F-FDG) é comumente utilizada para estudos de rastreio celular por PET 3, 13. Uma grande desvantagem deste marcador de PET, no entanto, é a meia-vida curta do radionuclídeo 18 M em 109,7 min e a baixa estabilidade intracelular que impede a imagiologia em pontos de tempo mais tardios após a transferência adoptiva de células. Para longo prazo, os estudos in vivo de rastreio celular por PET, embora instável nas células, 64 Cu-PTSM é frequentemente usado para marcar as células não especificamente 14, 15, com efeitos prejudiciais minimizadas sobre a viabilidade das células T e a função de 16.

Este protocolo descreve um método para reduzir ainda mais os efeitos desvantajosos sobre a viabilidade e função das células utilizando um receptor de células T (TCR) de mAb marcado radioactivamente espec�ico. Em primeiro lugar, a produção do radioisótopo 64 Cu, a conjugação do mAb KJ1-26 com the quelante DOTA, e o subsequente 64 de Cu-radiomarcação são mostrados. Num segundo passo, o isolamento e a expansão de células TH1 Cova-de ratinhos dadores DO11.10 e a radiomarcação com 64Cu-carregado DOTA-conjugado mAb KJ1-26 (64 Cu-DOTA-KJ1-26) são descritos em detalhe. A avaliação dos valores de absorção e de efluxo de radioactividade com um calibrador de doses e pela y-contagem, respectivamente, bem como a avaliação dos efeitos de 64 Cu-radiomarcao sobre a viabilidade celular por exclusão com azul de tripano e funcionalidade com ELISA y IFN-são apresentados . Para não invasiva no rastreamento de células in vivo, o desencadeamento de um modelo de ratinho de-induzida aguda das vias aéreas Cova DTHR e aquisição de imagem por PET / CT após transferência adoptiva de células encontram-se descritos.

Além disso, esta abordagem de marcao podem ser transferidos para diferentes modelos de doença, as células T de murídeo com diferentes TCRs ou células gerais de interesse com receptores ligados a membranas ou mar expressãokers subjacente membrana contínua de vaivém 17.

Protocol

Medidas de Segurança: Ao manusear radioactividade, armazenar 64 Cu atrás tijolos de chumbo 2 polegadas de espessura e utilizar respectivo blindagem para todos os vasos que transportam actividade. Use ferramentas apropriadas para tratar indiretamente fontes não blindados para evitar contato manual direto e minimizar a exposição a material radioativo. Sempre use radiação emblemas monitoramento dosimetria e equipamentos de proteção individual e verificar-se ea área de trabalho para a contaminação de …

Representative Results

A Figura 1 resume a marcação das células Cova-TH1 com o 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e a concepção experimental para o in vitro e em estudos in vivo abrangidos neste protocolo. Figura 1: 64 de Cu-DOTA-KJ1-26-mAb processo de etiquetagem & Desenho Experimental. (A)</…

Discussion

Este protocolo apresenta um método de confiança e fácil de radiomarcar estavelmente células para o rastreamento in vivo por PET. Utilizando este método, as células Cova-TH1, isoladas e expandidas in vitro a partir de ratinhos dadores, poderia ser marcado radioactivamente com 64 Cu-DOTA-KJ1-26-mAb e sua homing foi rastreado para o LNS pulmonares e perithymic como locais de apresentação em um Cova Cova-induzida DTHR aguda das vias aéreas.

A modificação d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores agradecem a Dr. Julia Mannheim, Walter Ehrlichmann, Ramona Stumm, Funda Cay, Daniel Bukala, Maren Harant, bem como Natalie Altmeyer pelo apoio durante a análise experiências e dados. Este trabalho foi apoiado pela Werner Siemens-Foundation, o DFG através do SFB685 (B6 projeto) e Fortune (2309-0-0).

Materials

HCl, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.00318 64Cu production
Methanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.06007 64Cu production
Isopropanol, Suprapur Merck, Darmstadt, Germany 1.0104 64Cu production
Pt/Ir (90/10) plate Ögussa Custom made 64Cu production
PEEK chamber Ögussa Custom made 64Cu production
64Ni Chemotrade 64Cu production
Polygram SIL G/UV 254 plate Macherey-Nagel 805021 64Cu production
Ion exchange column BioRad AG1-X8 64Cu production
Solid state target system for PETtrace WKL costum made 64Cu production
64Cu work-up module WKL costum made 64Cu production
Dose calibrator Capintec CRC-25R
PETtrace cyclotron General Electric Medical Systems
DOTA-NHS Macrocyclics B-280 DOTA-conjugation
Anti-cOVA-TCR antibody (KJ1-26) Isolated from hybridoma cell culture DOTA-conjugation
Na2HPO4 Sigma-Aldrich 71633 DOTA-conjugation
H+ Chelex 100 Sigma-Aldrich C7901 DOTA-conjugation
Amicon Ultra-15 filter unit Merck Millipore UFC910008 DOTA-conjugation
Rotipuran ultrapure water Carl Roth HN68.3 DOTA-conjugation
Ammonium acetate Sigma-Aldrich 32301 DOTA-conjugation
PBS University Tuebingen DOTA-conjugation
Micro Bio-spin P-6 column Bio-Rad Laboratories 7326221 DOTA-conjugation
Sodium citrate Sigma-Aldrich 71497 DOTA-conjugation
Cyclone Plus PhosphorImager  Perkin-Elmer L2250116 DOTA-conjugation
DMEM Merck Millipore 102568 ingredient for T cell medium 
FCS Merck Millipore S0115/1004B ingredient for T cell medium 
Sodium pyruvate Merck Millipore L0473 ingredient for T cell medium 
MEM-amino acids Merck Millipore K0293 ingredient for T cell medium 
HEPES  Merck Millipore L 1613 ingredient for T cell medium 
 Penicillin/Streptomycin Merck Millipore A2212 ingredient for T cell medium 
0.05 mM 2-β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148 ingredient for T cell medium 
DO11.10 mice in-house breeding TH1 cell culture
DPBS Gibco 14190144 TH1 cell culture
Cell strainer 40 µm  Corning 352340 TH1 cell culture
ACK Lysing Buffer Lonza 10-548E TH1 cell culture
CD4 MicroBeads, mouse Miltenyi Biotech 130-097-145 TH1 cell culture
QuadroMACS separator Miltenyi Biotech 130-090-976 TH1 cell culture
LS column Miltenyi Biotech 130-042-401 TH1 cell culture
anti-CD4 antibody (Gk1.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
anti-CD8 antibody (5367.2) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Anti-rat antibody (MAR18.5) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
Rabbit complement MA tebu-Bio CL3221 TH1 cell culture
Anti-IL-4 antibody (11B11) Isolated from hybridoma cell culture TH1 cell culture
cOVA 323-339-peptide  EMC-micro-collections Custom order TH1 cell culture
CPG1668-oligonucleotides Eurofins MWG Operon Custom order TH1 cell culture
IL-2 Novartis 65483-116-07 TH1 cell culture
96-well plates Greiner  655180 TH1 cell culture
24-well plates Greiner  662160 TH1 cell culture
cell culture flask Greiner  660175 TH1 cell culture
48-well plates Greiner  677 180 cell labeling
Gammacell 1000 Best Theratronics via inquiry 
Gulmay RT225 Gulmay via inquiry 
Trypan blue Merck Millipore L6323 in vitro evaluation
Mouse IFN-γ ELISA BD Biosciences 558258 in vitro evaluation
PE Annexin V Apoptosis Detection Kit  BD Biosciences 559763 in vitro evaluation
Tube 5 ml Sarstedt 55.476 in vitro evaluation
Round-bottom tubes  BD Biosciences 352008 in vitro evaluation
Wizard γ-counter Perkin-Elmer 2480-0010 in vitro evaluation
ELISA Reader MultiscanEX Thermo Fisher Scientific 51118177 in vitro evaluation
Microscope Leica via inquiry  in vitro evaluation
BD LSRII  BD Biosciences via inquiry  in vitro evaluation
BALB/c mice Charles River 028 in vivo cell trafficking
Aluminum gel Serva Electrophoresis 12261.01 in vivo cell trafficking
Xylazine Bayer HealthCare Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Ketamine Ratiopharm Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
Isoflurane CP-Pharma Ordered via University hospital in vivo cell trafficking
30G needle BD Biosciences 304000 in vivo cell trafficking
Syringe BD Biosciences 11612491 in vivo cell trafficking
Capillaries 10 µl VWR 612-2439
Inveon PET scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking, alternative companies: Bruker, Mediso 
Inveon SPECT/CT scanner Siemens Healthineers no longer available in vivo cell trafficking
Inveon Research Workplace Siemens Healthineers image analysis, alternative software: Pmod

References

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Hoffmann, S. H. L., Maurer, A., Reck, D. I., Reischl, G., Pichler, B. J., Kneilling, M., Griessinger, C. M. Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT. J. Vis. Exp. (122), e55270, doi:10.3791/55270 (2017).

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