In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
Meme kanseri ölümlerinin önde gelen nedenidir metastazı 1, 2 geçer. Birinci basamak metastatik meme kanseri, 2, 3, 4, 5, 6 tedavisinde rejimleri gibi dosetaksel ve paklitaksel gibi taksanlarm kendilerine hidrofobik şu anda kullanılmaktadır. Onlar mikrotübül dinamiklerini bozabilir mikrotübül hedefleme ajanları (MTAs) bir grubun parçasıdır. Ancak, küratif tedavi taksan kullanarak en büyük sorunlardan biri nüks 7 neden kanser hücrelerinde taksan direnci, geliştirilmesidir. İlaç direnci metastatik meme kanseri 7 olan hastalarda, tüm ölümlerin% 90'dan fazla sorumludur.
Mikrotübüller α- ve β-tübülin heterodimerlerinin polimerizasyonuyla oluşurclass = "xref"> 8, 9. mikrotubul dinamiği kesin düzenlemesi, hücre polarizasyon, hücre döngüsü ilerlemesinin, hücre içi ulaşım ve hücre sinyalizasyon dahil olmak üzere birçok hücre fonksiyonları için önemlidir. Mikrotübüllerin ve dinamikleri bozulması hücre fonksiyonunu bozabilir ve hücre ölümü 10, 11 neden olur. Bu sistem bozukluğu neden bağlı olarak, MTA ilaçlar mikrotübül stabilize edici ajanlar (örneğin, taksanlar) ya da mikrotübül destabalizing maddeler (örneğin, vinka alkaloidler ve kolşisin yerinde bağlama maddeleri), 20, ya da sınıflandırılabilir. Mikrotübül kütlesi üzerindeki zıt etkilerine rağmen, yeterli dozda, hem sınıflar mikrotübül dinamiklerine 21 üzerindeki etkileri yoluyla kanser hücrelerini öldürür.
Taksan yol açan mikrotübül mili 12 dengeleyici öncelikle işlevkromozomal hiza. mili montaj kontrol noktasında (SAC) sonraki sürekli aktivasyon mitoz hücreyi tutuklamalar. Uzamış mitotik tutuklama daha sonra apoptoz 13, 14 olur. Taksan monte tubulin 16 sadece mevcut olan β-tubulin 8, 15, ilgili taksan bağlanma sitesi üzerinden mikrotübüller ile etkileşime girer.
Taksan direnç çok mekanizma 17 9 önerilmiştir. Bu mekanizmalar sayesinde ilaç akış proteinler ve taksan özgü direnci 5, 9, 18, 19 aşın hem genel hem de çoklu ilaç direncini kapsamaktadır. Örneğin, taksan dirençli kanser hücreleri, bazı β-küvet ekspresyonu ve fonksiyonunu değiştirmiş olabilirUlin 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23 izotipleri. Mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için bir in vivo yöntem kullanarak, dirençli olmayan ebeveyn MCF-7 hücreleri CC 17 ile karşılaştırıldığında, dosetaksel dayanıklı MCF-7 TXT hücrelerin mikrotübül dinamiklerinin dosetaksel tedaviye duyarlı olduğunu göstermektedir.
Daha iyi MTAs işlevini ve kanserli hücrelerde taksan direnci tam mekanizmasını anlamak için, mikrotübül dinamiklerini ölçmek için esastır. Burada, bu sayede, bir in vivo yöntem sunulmaktadır. Hücrelerinde GFP-etiketli tubulin sentezlenmesi ile birlikte canlı görüntüleme kullanarak, MCF-7 TXT ve MCF-7 hücreleri CC ve wi mikrotübül dinamiklerinin ölçebilirthout dosetaksel tedavisi. Sonuçlar bize taksan direncini aşmak için daha etkili ilaçlar tasarlamaya yardımcı olabilir.
In vitro ve in vivo: mikrotübül Dinamik dengesizlik ölçmek için iki ana yöntem vardır. In vitro yöntemde, saflaştırılmış tubulin bilgisayar destekli zaman atlamalı diferansiyel girişim kontrast mikroskobu ile mikrotübül dinamik istikrarsızlık ölçmek için kullanılır. In vivo metodunda, floresan tubulin mikroenjeksiyon ya da GFP-tubulin ifade mikrotübüllere dahil edilir. Mikrotübül dinamikleri (büyüme ve kısalma) sonra fazlar arası hücrelerinin …
The authors have nothing to disclose.
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |