In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
A principal causa de mortalidade por câncer de mama é através de metástases 1, 2. Os taxanos, como o docetaxel e o paclitaxel, são actualmente utilizados como esquemas de primeira linha para o tratamento de cancro da mama metastático 2, 3, 4, 5, 6. Eles fazem parte de um grupo de agentes de metas de microtúbulos (MTA) que interrompem a dinâmica dos microtúbulos. No entanto, um dos maiores desafios para a utilização em terapia curativa taxanos é o desenvolvimento de resistência taxano em células de cancro, o que leva à recorrência da doença sete. A resistência às drogas é responsável por mais de 90% de todas as mortes entre os pacientes com câncer de mama metastático 7.
Os microtúbulos são formados pela polimerização de heterodímeros a- e p-tubulinaclass = "xref"> 8, 9. A regulação exacta da dinâmica dos microtúbulos é importante para muitas funções celulares, incluindo a célula de polarização, progressão do ciclo celular, o transporte intracelular e a sinalização celular. Desregulação dos microtúbulos e sua dinâmica irá interromper a função das células e resultar em morte celular 10, 11. Dependendo de como eles causam esta desregulação, drogas MTA pode ser classificada quer como agentes de estabilização de microtúbulos (isto é, taxanos) ou agentes de microtúbulos-destabalizing (isto é, alcalóides vinca, colchicina ou local agentes de ligação) 20. Apesar dos seus efeitos opostos sobre a massa de microtúbulos, numa dosagem suficiente, ambas as classes podem matar as células cancerosas através dos seus efeitos sobre a dinâmica dos microtúbulos 21.
Os taxanos funcionar primariamente por estabilização de microtúbulos do fuso 12, levando adesalinhamento cromossómico. A subsequente activação perpétua do checkpoint de montagem do fuso (SAC) prende a célula na mitose. Paragem da mitose prolongado, em seguida, faz com que a apoptose 13, 14. Taxano interage com os microtúbulos através do sítio de ligação taxano em β-tubulina 8, 15, que só está presente no tubulina montados 16.
Vários mecanismos de resistência de taxano têm sido propostos 9, 17. Estes mecanismos incluem tanto a resistência a múltiplas drogas em geral, devido à sobre-expressão de proteínas e de resistência 5, 9, 18, 19 específicos de taxano de droga-efluxo. Por exemplo, as células cancerosas resistentes a taxano podem ter alterado a expressão e função de certos β-banheiraUlin isotipos 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Ao usar um método in vivo para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos, mostra-se que, quando comparado com a não-resistentes, parentais células MCF-7 CC 17, a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 resistente ao TXT docetaxel são insensíveis ao tratamento com docetaxel.
Para entender melhor a função de MTAs e o mecanismo exacto de taxano-resistência em células cancerosas, que é essencial para medir a dinâmica dos microtúbulos. Aqui, nós relatamos um método in vivo de fazê-lo. Utilizando imagens ao vivo em associação com a expressão de tubulina GFP em células, pode-se medir a dinâmica dos microtúbulos de células MCF-7 TXT e células MCF-7 com CC e without tratamento com docetaxel. Os resultados podem nos ajudar a projetar drogas mais eficazes que podem superar a resistência taxano.
Existem dois métodos principais para medir instabilidade dinâmica dos microtúbulos: in vitro e in vivo. No método in vitro, tubulina purificada é usada para medir a instabilidade dinâmica dos microtúbulos com microscopia de contraste de interferência diferencial-lapso de tempo melhorado-computador. No método in vivo, microinjectados tubulina fluorescente, ou expressaram a GFP-tubulina, é incorporado em microtúbulos. A dinâmica (crescimento e encurtamento) dos microtúbulos…
The authors have nothing to disclose.
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |