In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
السبب الرئيسي لوفيات سرطان الثدي هو ورم خبيث من خلال 1، 2. Taxanes، مثل DOCETAXEL وباكليتاكسيل، وتستخدم حاليا منصب نظم الخط الأول في علاج سرطان الثدي النقيلي 2، 3، 4، 5، 6. وهم جزء من مجموعة من العوامل التي تستهدف أنيبيب (الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف) التي تعطل ديناميات أنيبيب. ومع ذلك، واحدة من أكبر التحديات التي تواجه استخدام taxanes في العلاج العلاجية هو تطور مقاومة التاكسين في الخلايا السرطانية، الأمر الذي يؤدي إلى تكرار المرض 7. حسابات مقاومة العقاقير لأكثر من 90٪ من مجموع وفيات بين المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي النقيلي 7.
تتشكل الأنابيب الدقيقة عن طريق بلمرة heterodimers ألفا و-β تويولينالطبقة = "XREF"> 8 و 9. تنظيم دقيق للديناميات أنيبيب مهم للعديد من الوظائف الخلوية، بما في ذلك الاستقطاب الخلايا، تقدم دورة الخلية والنقل داخل الخلايا، وإشارات الخلية. سوف ديسريغولاتيون من الأنابيب الدقيقة وديناميتها تعطيل وظائف الخلايا ويؤدي إلى موت الخلايا 10 و 11. اعتمادا على الكيفية التي تسبب هذه التقلبات، والمخدرات MTA يمكن أن تصنف على أنها إما أنيبيب استقرار وكلاء (أي taxanes) أو وكلاء أنيبيب-destabalizing (أي قلويدات فينكا أو الموقع الكولشيسين وكلاء ملزمة) 20. وعلى الرغم من آثار عكسية على كتلة أنيبيب، في جرعة كافية، يمكن أن كلتا الفئتين تقتل الخلايا السرطانية عن طريق تأثيرها على ديناميات أنيبيب 21.
Taxanes تعمل في المقام الأول عن طريق تثبيت المغزل أنيبيب 12، مما أدى إلىاختلال الكروموسومات. تفعيل دائم لاحق من حاجز الجمعية المغزل (SAC) يعتقل خلية في الانقسام. ثم يسبب اعتقال الإنقسامية لفترات طويلة موت الخلايا المبرمج 13 و 14. التاكسين تتفاعل مع الأنابيب الدقيقة من خلال موقع التاكسين ملزم على β تويولين 8 و 15، التي هي موجودة فقط في تويولين تجميعها 16.
وقد تم اقتراح آليات متعددة للمقاومة التاكسين 9، 17. وتشمل هذه الآليات على حد سواء المقاومة للأدوية المتعددة العامة بسبب overexpression من البروتينات هروب رأس المال من المخدرات والتاكسين محددة المقاومة 5، 9، 18، 19. على سبيل المثال، الخلايا السرطانية مقاومة للالتاكسين قد غيرت التعبير وظيفة الحوض β معينفي Ulin isotypes 5، 9، 19، 20، 21، 22، 23. باستخدام الأسلوب في الجسم الحي لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي، وتبين لنا أن، بالمقارنة مع غير مقاومة لل، الوالدين قدم مكعبة-7 خلايا CC 17، وديناميات أنيبيب من خلايا MCF-7 TXT مقاومة للDOCETAXEL لا تعير اهتماما للعلاج DOCETAXEL.
من أجل فهم أفضل وظيفة من الاتفاقات التجارية المتعددة الأطراف والآلية الدقيقة لالتاكسين المقاومة في الخلايا السرطانية، لا بد من قياس ديناميات أنيبيب. هنا، ونحن التقرير وسيلة في الجسم الحي للقيام بذلك. باستخدام التصوير الحي في تركيبة مع التعبير عن تويولين الموسومة GFP في الخلايا، يمكننا قياس ديناميات أنيبيب من قدم مكعبة-7 TXT وMCF-7 خلايا CC مع ووايthout العلاج DOCETAXEL. فإن النتائج يمكن أن تساعدنا في تصميم أدوية أكثر فعالية التي يمكن التغلب على مقاومة التاكسين.
هناك طريقتان الرئيسية لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي: في التجارب المختبرية والحية. في هذه الطريقة في المختبر، يتم استخدام تويولين تنقيته لقياس أنيبيب عدم الاستقرار الديناميكي مع مرور الزمن المجهر التفاضلية التدخل النقيض محسنة الكمبيوتر….
The authors have nothing to disclose.
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |