In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
La principale cause de mortalité par cancer du sein est par métastase 1, 2. Taxanes, tels que le docétaxel et le paclitaxel, sont actuellement utilisés comme schémas de première intention dans le traitement du cancer du sein métastatique , 2, 3, 4, 5, 6. Ils font partie d'un groupe d'agents de microtubules-ciblage (ATM) qui perturbent la dynamique des microtubules. Cependant, l' un des plus grands défis à l' utilisation de taxanes dans le traitement curatif est le développement de la résistance de taxane dans les cellules cancéreuses, ce qui conduit à la maladie récidive 7. Représente la résistance aux médicaments pour plus de 90% de tous les décès chez les patients atteints d' un cancer du sein métastatique 7.
Les microtubules sont formés par la polymérisation des hétérodimères a et ß-tubulineclass = "xref"> 8, 9. La régulation précise de la dynamique des microtubules est important pour de nombreuses fonctions cellulaires, y compris la polarisation cellulaire, de la progression du cycle cellulaire, le transport intracellulaire et la signalisation cellulaire. Dysrégulation des microtubules et leur dynamique va perturber la fonction cellulaire et provoquer la mort cellulaire 10, 11. Selon la façon dont ils provoquent cette dysrégulation, les médicaments MTA peuvent être classés comme des microtubules agents stabilisants ( par exemple, taxanes) ou agents microtubules destabalizing (ie, vinca – alcaloïdes ou colchicine site des agents de liaison) 20. En dépit de leurs effets opposés sur la masse des microtubules, à une dose suffisante, les deux classes peuvent tuer les cellules cancéreuses grâce à leurs effets sur la dynamique des microtubules 21.
Les taxanes fonctionnent principalement par la stabilisation de la broche microtubules 12, conduisant àdésalignement chromosomique. L'activation perpétuelle ultérieure du point de contrôle de l'assemblage de broche (SAC) arrête la cellule en mitose. Prolongée mitotique arrestation provoque alors l' apoptose 13, 14. Taxane interagit avec les microtubules par le biais du site de liaison du taxane sur la β-tubuline 8, 15, qui est présent seulement dans la tubuline 16 assemblé.
Plusieurs mécanismes de résistance aux taxanes ont été proposées 9, 17. Ces mécanismes comprennent à la fois la multirésistance générale due à la surexpression de protéines et spécifiques de taxane de la résistance 5, 9, 18, 19 médicaments efflux. Par exemple, les cellules cancéreuses résistantes à un taxane peut avoir modifié l'expression et la fonction de certaines β-tubulin isotypes 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. En utilisant une méthode in vivo pour mesurer microtubules instabilité dynamique, on montre que, par rapport aux parents cellules MCF-7 non résistantes, CC 17, la dynamique des microtubules des cellules MCF-7 TXT docétaxel résistantes sont insensibles à un traitement par le docétaxel.
Pour mieux comprendre la fonction de MTAs et le mécanisme exact de taxane-résistance dans les cellules cancéreuses, il est essentiel de mesurer la dynamique des microtubules. Nous rapportons ici une méthode in vivo de le faire. En utilisant l' imagerie en direct en combinaison avec l'expression de la tubuline GFP-marqués dans les cellules, nous pouvons mesurer la dynamique des microtubules de MCF-7 TXT et MCF-7 cellules CC avec et wiThoout traitement par le docétaxel. Les résultats peuvent nous aider à concevoir des médicaments plus efficaces qui peuvent surmonter la résistance de taxane.
Il existe deux méthodes principales pour mesurer microtubules instabilité dynamique: in vitro et in vivo. Dans le procédé in vitro, la tubuline purifiée est utilisée pour mesurer l' instabilité microtubules dynamique avec time-lapse interférence différentielle-microscopie à contraste amélioré par ordinateur. Dans le procédé in vivo, microinjecté tubuline fluorescente ou exprimé GFP-tubuline en microtubules est incorporé. La dynamique (croissance et de raccourcisse…
The authors have nothing to disclose.
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |