In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
La causa principal de la mortalidad del cáncer de mama es a través de la metástasis 1, 2. Los taxanos, tales como docetaxel y paclitaxel, se utilizan actualmente como regímenes de primera línea en el tratamiento de cáncer de mama metastásico 2, 3, 4, 5, 6. Son parte de un grupo de agentes de microtúbulos orientación (MTA) que interrumpen la dinámica de los microtúbulos. Sin embargo, uno de los mayores desafíos para el uso de taxanos en el tratamiento curativo es el desarrollo de resistencia a taxanos en células cancerosas, lo que conduce a la recurrencia de la enfermedad 7. La resistencia a fármacos es responsable de más del 90% de todas las muertes entre los pacientes con cáncer de mama metastásico 7.
Los microtúbulos se forman por la polimerización de heterodímeros alfa y beta tubulinaclass = "xref"> 8, 9. La regulación precisa de la dinámica de microtúbulos es importante para muchas funciones celulares, incluyendo la polarización celular, progresión del ciclo celular, el transporte intracelular y la señalización celular. La desregulación de los microtúbulos y su dinámica va a alterar la función celular y provocar la muerte celular 10, 11. Dependiendo de la forma en que causan este desregulación, drogas MTA se pueden clasificar como agentes estabilizantes de microtúbulos (es decir, taxanos) o agentes de microtúbulos destabalizing (es decir, alcaloides de la vinca o la colchicina-sitio de agentes de unión) 20. A pesar de sus efectos opuestos sobre la masa de los microtúbulos, a una dosis suficiente, ambas clases pueden matar a las células cancerosas a través de sus efectos sobre la dinámica de los microtúbulos 21.
Los taxanos funcionan principalmente mediante la estabilización de los microtúbulos del huso 12, que conduce adesalineación cromosómico. La activación perpetua posterior de la asamblea de control de huso (SAC) detiene el celular en la mitosis. Mitótico detención prolongada provoca entonces la apoptosis 13, 14. Taxano interactúa con los microtúbulos a través del sitio de unión de taxano en β-tubulina 8, 15, que sólo está presente en tubulina ensamblada 16.
Se han propuesto múltiples mecanismos de resistencia taxano 9, 17. Estos mecanismos incluyen tanto resistencia a múltiples fármacos en general debido a la sobreexpresión de las proteínas y los taxanos específico resistencia 5, 9, 18, 19 de flujo de salida con las drogas. Por ejemplo, las células cancerosas resistentes a taxanos puede haber alterado la expresión y la función de determinadas β-bañeraUlin isotipos 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. Mediante el uso de un método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos, se muestra que, en comparación con, células MCF-7 CC parentales no resistentes 17, la dinámica de los microtúbulos de células MCF-7 TXT docetaxel resistentes son insensibles al tratamiento con docetaxel.
Para entender mejor la función de los ATM y el mecanismo exacto de taxano-resistencia en las células cancerosas, es esencial para medir la dinámica de microtúbulos. Aquí, se presenta un método in vivo de hacerlo. Mediante el uso de imágenes en vivo en combinación con la expresión de la tubulina marcado con GFP en las células, podemos medir la dinámica de los microtúbulos de las células MCF-7 TXT y células MCF-7 con CC y wiThout tratamiento con docetaxel. Los resultados pueden ayudar a diseñar fármacos más efectivos que puedan superar la resistencia taxano.
Hay dos métodos principales para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos in vitro y en vivo. En el método in vitro, la tubulina purificada se utiliza para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos con lapso de tiempo diferencial de interferencia de microscopía de contraste mejorado por computadora. En el método in vivo, microinyectó tubulina fluorescente, o se expresa GFP-tubulina, se incorpora en los microtúbulos. La dinámica (crecimiento y acortamien…
The authors have nothing to disclose.
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |