In this paper, we report a protocol describing an in vivo method to measure microtubule dynamic instability in docetaxel-resistant breast cancer cells (MCF-7TXT). In this method, a deconvolution microscopy imaging system is used to detect the expression of GFP-tubulin in target cells.
Taxanes such as docetaxel belong to a group of microtubule-targeting agents (MTAs) that are commonly relied upon to treat cancer. However, taxane resistance in cancerous cells drastically reduces the effectiveness of the drugs’ long-term usage. Accumulated evidence suggests that the mechanisms underlying taxane resistance include both general mechanisms, such as the development of multidrug resistance due to the overexpression of drug-efflux proteins, and taxane-specific mechanisms, such as those that involve microtubule dynamics.
Because taxanes target cell microtubules, measuring microtubule dynamic instability is an important step in determining the mechanisms of taxane resistance and provides insight into how to overcome this resistance. In the experiment, an in vivo method was used to measure microtubule dynamic instability. GFP-tagged α-tubulin was expressed and incorporated into microtubules in MCF-7 cells, allowing for the recording of the microtubule dynamics by time lapse using a sensitive camera. The results showed that, as opposed to the non-resistant parental MCF-7CC cells, the microtubule dynamics of docetaxel-resistant MCF-7TXT cells are insensitive to docetaxel treatment, which causes the resistance to docetaxel-induced mitotic arrest and apoptosis. This paper will outline this in vivo method of measuring microtubule dynamic instability.
הגורם המוביל לתמותה מסרטן השד הוא באמצעות גרורות 1, 2. Taxanes, כגון docetaxel ו- paclitaxel, משמש כיום כקו ראשון משטר לטיפול בסרטן השד גרורתי 2, 3, 4, 5, 6. הם חלק מהקבוצה של סוכני מיקוד-microtubule (MTAs) משבשי דינמיקת microtubule. עם זאת, אחד האתגרים הגדולים ביותר באמצעות taxanes בטיפול מרפא הוא הפיתוח של התנגדות taxane בתאים סרטניים, אשר מובילה למחלות ישנות 7. עמידות לתרופות אחראית ליותר מ -90% מכלל מקרי המוות בקרב חולי סרטן שד גרורתי 7.
Microtubules נוצרות על ידי פילמור של heterodimers α- ו β טובוליןclass = "Xref"> 8, 9. ההתקנה המדויקת של דינמיקת microtubule חשובה תפקודים תאיים רבים, כולל קיטוב תא, התקדמות מחזור התא, תחבורה תאית, ואיתות תא. חוסר וויסות של microtubules והדינמיקה שלהם ישבש תפקוד התא לגרום מוות של תאים 10, 11. תלוי איך הם לגרום חוסר וויסות זה, תרופות MTA ניתן לסווג גם כסוכני ייצוב microtubule (כלומר, taxanes) או סוכני microtubule-destabalizing (כלומר, אלקלואידים וינקה או באתר קולכיצין סוכנים מחייב) 20. למרות ההשפעות שלהם הפוכות על מונית microtubule, במינון מספיק, כיתות שניהם יכולות להרוג תאים סרטניים באמצעות השפיע על דינמיקת microtubule 21.
Taxanes לתפקד בעיקר על ידי ייצוב microtubule ציר 12, המובילחוסר תיאום כרומוזומליות. ההפעלה התמידית הבאה של מחסום הרכבת ציר (SAC), עוצרת את תא מיטוזה. מעצר mitotic ממושך ואז גורם לאפופטוזיס 13, 14. Taxane אינטראקציה עם microtubules דרך האתר taxane מחייב על β טובולין 8, 15, אשר שוהה רק טובולין התאספו 16.
מנגנונים מרובים להתנגדות taxane הוצעו 9, 17. מנגנונים אלה כוללים הן התנגדות multidrug כללית בשל ביטוי יתר של חלבונים-בזרימת סמים taxane ספציפי התנגדות 5, 9, 18, 19. לדוגמא, תאים סרטניים עמיד taxane יש בו כדי לשנות ביטוי ותפקוד של β-גיגית מסוימתulin isotypes 5, 9, 19, 20, 21, 22, 23. באמצעות שיטה in vivo למדוד חוסר יציבות microtubule דינמי, אנו מראים כי, כאשר בהשוואה ללא-עמיד, תאי CC MCF-7 הוריה 17, דינמיקת microtubule של תאי docetaxel העמיד MCF-7 TXT הן רגישה לטיפול docetaxel.
כדי להבין טוב יותר את הפונקציה של MTAs ואת המנגנון המדויק של התנגדות taxane בתאים סרטניים, זה הכרחי למדוד דינמיקת microtubule. כאן אנו מדווחים שיטה in vivo לעשות זאת. באמצעות הדמיה חיה בשילוב עם ביטוי של טובולין-tagged GFP בתאים, אנו יכולים למדוד את הדינמיקה microtubule של TXT MCF-7 ותאי CC MCF-7 עם ואינטרנטthout טיפול docetaxel. התוצאות יכולות לעזור לנו לעצב תרופות יעילות יותר שיכול להתגבר על התנגדות taxane.
ישנן שתי שיטות עיקריות למדידת חוסר יציבות microtubule דינמי: במבחנה in vivo. בשיטה במבחנה, טובולין מטוהר משמש למדידת חוסר יציבות microtubule דינמית עם מיקרוסקופיה מחשב משופר זמן לשגות הפרש התערבות ניגודיות. בשיטת in vivo, microinjected טובולין ניאון, או הביע GFP-טובולין, ה?…
The authors have nothing to disclose.
This research is supported by funding from CBCF (to ZW).
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies, Invitrogen | 11140-050 | |
FBS | Gibco, Invitrogen | 12483 | |
Anti-Anti (100x) | Life Technologies, Invitrogen | 15240-062 | |
docetaxel | Sigma-Aldrich | 01885-5mg-F | |
DMEM phenol red-free | Gibco, Invitrogen | 21063 | |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP-tubulin | ThermoFisher Scientific | C10613 | Key reagent for expressing GFP tubulin in cells |
CellLight Reagent *BacMam 2.0* GFP | ThermoFisher Scientific | B10383 | Control |
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich+B9:AA9 | 472301 | for dissoving decetaxel |
22-mm glass coveslip | Fisher Scientifics | 12-545-101 | |
6-well culture plate | Greiner Bio-One International | 6 Well Celi Culture Plate | |
DeltaVision Microscopy Imaging Systems | GE Health | This system is equipped with weather station for controlling temperature and CO2. It also equipped with Worx Software for deconvolution and time lapse control. | |
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
Bright-Line Hemacytometer Set, Hausser Scientific | Hausser Scientific, Distributed by VWR | Supplier No.: 1492 VWR No.:15170-172 |