La detección de la actividad endocrina en Uso de Agua comercialmente disponibles<em> In Vitro</em> Transactivación bioensayos
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
En los bioensayos de transactivación in vitro han mostrado prometedor como herramientas de supervisión de la calidad del agua, sin embargo, su adopción y aplicación generalizada se ha visto obstaculizada debido en parte a la falta de métodos estandarizados y la disponibilidad de la tecnología robusta, fácil de usar. En este estudio, se emplearon, líneas celulares de división a detener disponibles en el mercado para la detección cuantitativa de la actividad endocrina de los productos químicos presentes en las muestras de agua de interés para los profesionales de la calidad del medio ambiente. Un protocolo único, estandarizado que incluía aseguramiento de calidad / control de calidad (QA / QC) comprueba si se ha desarrollado para la actividad de estrógeno y receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente) utilizando un ensayo de fluorescencia la transferencia de energía de resonancia basado en células (FRET). Las muestras de los efluentes tratados municipal de aguas residuales y agua de superficie de sistemas de agua dulce en California (EE.UU.), se extrajeron mediante extracción en fase sólida y se analizó la actividad endocrina utilizando el proto estandarizadacolumna. Antecedentes y dosis-respuesta para los productos químicos de referencia de punto final específico cumplen las directrices de AC / CC que se consideren necesarias para la medición fiable. La respuesta de detección bioensayo para las muestras de agua de la superficie no era en gran parte detectable. Por el contrario, las muestras de efluentes de plantas de tratamiento secundario tuvieron la mayor actividad medible, con concentraciones equivalentes de bioensayo estimado (EQB) de hasta 392 ng de dexametasona / L para GR y 17 ng de 17β-estradiol / L para el ER. La respuesta bioensayo para una muestra de efluente terciario fue menor que el medido para los efluentes secundarios, lo que indica un residual inferior de endocrinos químicos activos después del tratamiento avanzado. Este protocolo mostró que en los bioensayos de transactivación in vitro que utilizan comercialmente disponible, la división celular detenido de "kits", se puede adaptar para la detección de la actividad endocrina en agua.
Introduction
El monitoreo actual calidad del agua se basa en la capacidad de medir con exactitud y precisión la presencia de contaminantes químicos como sustituto de la exposición a la fauna y los seres humanos. Sin embargo, esta vigilancia química por sustancia y paradigma de la evaluación no pueden seguir el ritmo del universo químico en constante cambio al que nos enfrentamos. A medida que aprendemos más sobre el destino y los efectos de los productos químicos sintéticos y naturales, continuamos la búsqueda de herramientas de medición que espera abordar los impactos biológicos, y que al mismo tiempo son inmunes a los cambios en la producción de sustancias químicas, el uso y la entrada del medio ambiente. Estas herramientas son especialmente relevantes para la comprensión de si las sustancias químicas desconocidas o nuevas, y productos de transformación, merecen nuestra atención. Por otra parte, mezclas complejas de productos químicos presentes en el agua están mal dirigidas por vigilancia química individual. Por lo tanto, nos encontramos ante el reto de la modernización de la caja de herramientas de monitoreo existente para abordar mejor estas cuestiones en las aguas superficiales del that recibir descarga de efluentes de aguas residuales tratadas y aguas de escorrentía / pluviales urbanos.
En los últimos años, las técnicas de bioanálisis se han mostrado prometedoras como herramientas de detección para la evaluación de la calidad del agua. En particular, los bioensayos, in'vitro que responden a las sustancias químicas que actúan por medio conocido, los modos específicos de acción 1,2 son de gran interés para la comunidad vigilancia del medio ambiente 3. Numerosas investigaciones han empleado en bioensayos in vitro para cuantificar la actividad endocrina del consumo de alcohol, la superficie y las aguas residuales 4 -6. Por otra parte, una serie de bioensayos objetivo sucesos iniciadores moleculares (por ejemplo, la activación del receptor), que puedan estar relacionadas con efectos nocivos a través de la vía resultado adverso analiza 7,8.
La evolución de bioscreening para la evaluación de la calidad del agua ha sido relativamente rápida, con cientos de diferentes puntos finales en bioensayos in vitro de haber sido evaluados por suutilidad de 9,10. En la actualidad, sólo un puñado de bioensayos se ha demostrado para lograr una buena precisión de la medida (dentro de los laboratorios) al tiempo que demuestra la capacidad de diferenciar entre las calidades de agua 5,6. Para los efluentes de aguas residuales tratadas, en particular, la aparición de los estrógenos y esteroides glucocorticoides ha sido exitosamente representaron para usar en ensayos de transactivación in vitro 11,12. bioensayos Sin embargo, la mayoría de los estudios hasta la fecha han empleado cuyas líneas celulares son de propiedad (y por lo tanto no están ampliamente disponibles), requieren de atención continua y la manipulación, o ambos. Como resultado, la capacidad de estandarizar protocolos, realizar ejercicios de calibración entre laboratorios, y en última instancia para transferir esta tecnología de detección para los recursos de agua de la comunidad sigue siendo impedida.
Al menos un proveedor de bioensayos in vitro examinados a través del programa de Estados Unidos ToxCast está disponible comercialmente en 13 fáciles de usar "congelación y descongelación4; formatos. Estas células "kits" de división-detenidos han demostrado ser robustos en la medición de la actividad de los productos químicos extraídos de agua que representan diferentes niveles de tratamiento 14. Aunque los protocolos de los proveedores están disponibles para detectar la bioactividad de los productos químicos individuales o mezclas, algunos de ellos requieren modificación antes de que se pueden aplicar a muestras de agua. Efluentes de aguas residuales tratadas 15, 16 escorrentía de aguas pluviales, aguas receptoras 17,18 y más recientemente reciclada 19,20 agua son los principales ejemplos de medios acuosos que son de interés para la comunidad de la calidad del agua.
En este estudio se presenta un protocolo único, estandarizado para medir la actividad endocrina en muestras de agua usando disponible en el mercado, la división-detenido en bioensayos de transactivación in vitro. Hemos demostrado la robustez del protocolo a través de una evaluación exhaustiva de fondo, la capacidad de respuesta de la dosis y la repetibilidad de la respuesta de two Los criterios de valoración de especial interés y estrógeno transactivación del receptor de glucocorticoides (GR y ER, respectivamente). El protocolo se aplicó a muestras de pantalla de efluentes de aguas residuales tratadas y aguas superficiales procedentes de sistemas de agua dulce en California.
Protocol
Representative Results
Discussion
La potencia bien documentado de los estrógenos ambientales, tales como 17β-estradiol (E2), Presentación de órdenes de estos productos químicos en concentraciones / L 23,24 ng. En este estudio, la respuesta ER para los efluentes de aguas residuales (rango de BEQ de: 2.3 a la 17 MAL E2 / L) fue algo superior a la reportada para efluente secundario de la EDAR de Australia 20, mientras que los EQB para las aguas superficiales (<0,5 a 4 ng E2 / L ) se encontraban dentro del rango reportado para …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
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