סיקור הפעילות האנדוקרינית במים באמצעות מסחרי-זמין<em> במבחנה</em> Transactivation bioassays
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
ב bioassays transactivation במבחנה הראתה הבטחה ככלים לניטור איכות מים, אולם יישומם ואת היישום נרחב התעכב בין היתר בשל חוסר שיטות סטנדרטיות וזמינות של טכנולוגיה חזקה, ידידותי למשתמש. במחקר זה, זמין מסחרי, שורות תאים נעצר חלוקה הועסקו להקרין כמותית לפעילות האנדוקרינית של כימיקלים נוכחים דגימות מים המעניינות מקצוע איכות סביבה. פרוטוקול יחיד, סטנדרטי שכלל אבטחת איכות מקיפה / בקרת איכות (QA / QC) בדיקות פותחתה עבור פעילות קולטן אסטרוגן Glucocorticoid (ER ו GR, בהתאמה) באמצעות העברת אנרגית תהודת קרינה מבוססת תאים assay (סריג). דוגמאות של השפכים שפכים עירוניים מטופלים ומים עיליים ממערכות מים מתוקים בקליפורניה (ארה"ב), חולצו באמצעות מיצוי שלב מוצק ונותחו לפעילות האנדוקרינית באמצעות פרוטו סטנדרטיתcol. רקע מנה-תגובה עבור כימיקלי התייחסות ספציפי נקודות קצה עומדים בכללי QA / QC כנחוץ למדידה אמינה. תגובת הקרנת מבדק עבור דגימות מים עיליות הייתה במידה רבה לא ניתן לגילוי. לעומת זאת, דגימות שפכים ממפעלים טיפול שניוני היו הפעילות למדידה הגבוהה ביותר, עם ריכוזים המקבילה מבדק משוער (BEQs) עד 392 ng dexamethasone / L עבור GR ו -17 ng 17β-אסטרדיול / L עבור ER. תגובת המבדק למדגמת שליישונים בשפכים הייתה נמוכה מזה שנמדד לקולחים משניים, מה שמעיד על התחתונה שיורית של כימיקלים האנדוקרינית פעילים לאחר טיפול מתקדם. פרוטוקול זה הראה כי ב bioassays transactivation במבחנה לנצל זמינים מסחרית, תא נעצר חלוקה "ערכות", ניתן להתאים למסך פעילות אנדוקרינית במים.
Introduction
לניטור איכות מים הנוכחי מבוסס על היכולת בודדת ומדויק למדוד את המופע של מזהמים כימיים כמו פרוקסי לחשיפת חיות ובני האדם. עם זאת, ניטור הפרדיגמה הערכה כימי-ידי-זה כימי לא יכול לעמוד בקצב עם היקום הכימי המשתנה שאנו מתמודדים איתה. ככל שאנו לומדים יותר על הגורל ואת ההשפעות של כימיקלים סינטטיים וטבעיים, אנו ממשיכים לחפש כלי מדידה שכתובת צפויות השפעות ביולוגיות, וכי בעת ובעונה האחת חסינים לשינויי ייצור כימיקלים, שימוש קלט סביבתי. כלים כאלה הם רלוונטיים במיוחד להבנה אם כימיקלים ידועים או חדשים, ומוצרים טרנספורמציה, ראויים לתשומת לבנו. יתר על כן, תערובות מורכבות של כימיקלים הנמצאים במים מופנות כהלכה על ידי ניטור כימי יחיד. לפיכך, אנו עומדים בפני האתגר של מודרניזציה של ארגז כלי בקרה קיים לכתובת טובה יותר את הנושאים הללו tha מים עילייםt לקבל הזרמת השפכים קולחין נגר עירוני / stormwater.
בשנים האחרונות, טכניקות bioanalytical הראו הבטחה ככלי הקרנה להערכת איכות מים. בפרט, bioassays in'vitro המגיב כימיקלים מתנהגים באמצעות ידוע, מצבי פעולה ספציפיים 1,2 הם עניין רב לקהילת הניטור הסביבתי 3. מספר מחקרים מועסקים bioassays במבחנה לכמת את הפעילות האנדוקרינית של שתייה, משטח wastewaters 4 -6. יתר על כן, מספר bioassays למקד אירועים מולקולריים ייזום (למשל, הפעלת קולטן) אשר ניתן לקשר פוטנציאל להשפעות המזיקות באמצעות מסלול תוצאה שלילי מנתח 7,8.
האבולוציה של bioscreening להערכת איכות מים כבר יחסית מהירה, עם מאה שונים קצה מבדק במבחנה לאחר הוערכה עבור שלהםשירות 9,10. נכון לעכשיו, רק קומץ של מבדקים הוכח להשיג דיוק מדידה טוב (בתוך מעבדות) תוך הפגנת היכולת להבחין בין איכויות מי 5,6. לקבלת קולחים קולחים בפרט, את המופע של אסטרוגנים סטרואידים בסטרואידים כבר היוו בהצלחה באמצעות מבחני transactivation במבחנה 11,12. עם זאת, רוב המחקרים שנערכו עד כה, המועסקים bioassays שורות תאים אשר הנם רכוש (ובכך אינו זמין נרחב), דורשים טיפול מתמשך ומניפולציה, או שניהם. כתוצאה מכך, היכולת לבצע סטנדרטיזציה פרוטוקולים, לבצע תרגילי כיול הבינה-מעבדה, ובסופו של דבר להעביר טכנולוגית הקרנה זה למשאבי מי הקהילה נשארה הפריעה.
לפחות ספק אחד של מבדקים במבחנה בדקה באמצעות תכנית ToxCast ארה"ב זמין מסחרי 13 קל לשימוש "הקפאת הפשרה4; פורמטים. חטיבת-נעצר אלו תא "ערכות" הוכחו להיות חזקים מדידת פעילותם של כימיקלים המופקים מים המייצגים רמות שונות של טיפול 14. למרות פרוטוקולי הספק זמינים להקרין את הפעילות הביולוגית של כימיקלים או תערובות בודדים, חלקם דורשים שינויים לפני שהם יכולים להיות מיושמים על דגימות מים. קולחים שפכים 15, נגר stormwater 16, קבלת המים 17,18 ועוד 19,20 מים ממוחזרים לאחרונה הם דוגמאות מובהקות של התקשורת מימית כי הם בעלי עניין לקהילה איכות המים.
מחקר זה מציג פרוטוקול יחיד, סטנדרטי למדוד את הפעילות האנדוקרינית בדגימות מים באמצעות זמינים מסחריים, חטיבה-נעצרה bioassays transactivation במבחנה. הפגנו חוסנו של פרוטוקול באמצעות הערכה מקיפה של הרקע, תגובתיות המינון ואת הדירות של התגובה twנקודות קצה o של אסטרוגן עניין מיוחד ו transactivation קולטן Glucocorticoid (ER ו GR, בהתאמה). הפרוטוקול היה מוחל על דגימות מסך השפכים קולחין ומים עיליים ממערכות מים מתוקים בקליפורניה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עוצמתה המתועדת היטב של אסטרוגנים סביבתיים, כגון 17β-אסטרדיול (E2), הקרנת כתבים לכימיקלים אלה בריכוזי ng / L 23,24. במחקר זה, תגובת ER לקולחי שפכים (טווח רר"מ: 2.3 כדי 17 ng E2 / L) היה גבוה במעט ודווח שפכים משניים מן WWTPs האוסטרלי 20, ואילו BEQs במים עיליים (<0.5 כדי -4 ננוגרם E2 /…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. . Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). . Direct potable reuse: a path forward. , (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
