Le dépistage de la Endocrine Activité en eau à l'aide disponibles dans le commerce<em> In vitro</em> Transactivation Bioassays
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
Dans les essais biologiques de transactivation in vitro ont montré des résultats prometteurs comme outils de surveillance de la qualité de l' eau, mais leur adoption et l' application généralisée a été entravée en partie à cause d'un manque de méthodes normalisées et la disponibilité de la technologie robuste, facile à utiliser. Dans cette étude, disponibles dans le commerce, les lignes de division cellulaire arrêtés ont été utilisés pour dépister quantitativement l'activité endocrinienne des substances chimiques présentes dans les échantillons d'eau d'intérêt pour les professionnels de la qualité de l'environnement. Un seul protocole standardisé qui comprenait assurance qualité / contrôle de la qualité (AQ / CQ) des contrôles a été développé pour l'activité œstrogène et récepteur des glucocorticoïdes (ER et GR, respectivement) en utilisant un essai Fluorescence Resonance Energy Transfer à base de cellules (FRET). Des échantillons de l'effluent traité des eaux usées municipales et de l'eau de surface des systèmes d'eau douce en Californie (USA), ont été extraits par extraction en phase solide et analysés pour l'activité endocrinienne utilisant le proto standardisécol. Contexte et dose-réponse pour les produits chimiques de référence spécifiques finaux remplies d'AQ / CQ directives jugées nécessaires pour une mesure fiable. La réponse de dépistage du bioessai pour les échantillons d'eau de surface est en grande partie non détectable. En revanche, les échantillons d'effluents des usines de traitement secondaire ont eu l'activité mesurable la plus élevée, avec des concentrations équivalentes de biodosage estimée (BEQ) jusqu'à 392 ng dexaméthasone / L pour GR et 17 ng 17β-estradiol / L pour ER. La réponse de l'essai biologique d'un échantillon d'effluent tertiaire est inférieure à celle mesurée pour les effluents secondaires, ce qui indique une faible résiduelle de perturbateurs endocriniens après le traitement avancé. Ce protocole a montré que dans les essais biologiques de transactivation in vitro qui utilisent disponibles dans le commerce, la cellule de division arrêté "kits", peut être adapté à l' écran pour l' activité endocrinienne dans l' eau.
Introduction
Current surveillance de la qualité de l'eau repose sur la capacité à mesurer avec précision et précisément la présence de contaminants chimiques comme un proxy pour l'exposition à la faune et les humains. Cependant, cette surveillance chimique par produit chimique et de l'évaluation de paradigme ne peuvent pas suivre le rythme de l'univers chimique en constante évolution que nous sommes confrontés. Comme nous en apprendre davantage sur le sort et les effets des produits chimiques synthétiques et naturels, nous continuons à chercher des outils de mesure qui répondent attendus impacts biologiques, et que dans le même temps sont insensibles aux variations de la production chimique, l'utilisation et l'entrée de l'environnement. Ces outils sont particulièrement pertinentes pour comprendre si des produits chimiques inconnus ou nouveaux, et les produits de transformation, méritent notre attention. En outre, des mélanges complexes de produits chimiques présents dans l'eau sont mal traités par une surveillance individuelle chimique. Ainsi, nous sommes confrontés au défi de la modernisation de la boîte à outils de surveillance existants pour mieux répondre à ces questions dans les eaux de surface that reçoivent décharge des effluents traités des eaux usées et urbain / ruissellement des eaux pluviales.
Au cours des dernières années, les techniques bioanalytiques ont montré des résultats prometteurs comme outils de dépistage pour l'évaluation de la qualité de l'eau. En particulier, les bioessais in'vitro qui répondent à des produits chimiques agissant par l' intermédiaire connu, les modes d'action spécifiques 1,2 sont d' un grand intérêt pour la communauté de surveillance de l' environnement 3. De nombreuses enquêtes ont utilisé dans des essais biologiques in vitro pour quantifier l'activité endocrinienne de l' eau potable, de surface et les eaux usées 4 -6. En outre, un certain nombre d'essais biologiques cibles événements initiateurs moléculaires (par exemple, l' activation du récepteur) qui peut potentiellement être liée à des effets délétères par voie de résultat défavorable des analyses 7,8.
L'évolution de la bioscreening pour l' évaluation de la qualité de l' eau a été relativement rapide, avec des centaines de différents paramètres dans les essais biologiques in vitro ayant été évalués pour leurutilitaire 9,10. Actuellement, seule une poignée d'essais biologiques a été démontré que pour obtenir une bonne précision de mesure (dans les laboratoires) tout en démontrant la capacité de différencier les qualités d'eau 5,6. Pour traiter les effluents d'eaux usées , en particulier, l'apparition d'oestrogènes et de glucocorticostéroïdes a bien été pris en compte pour l' utilisation dans des tests de transactivation in vitro 11,12. bioessais Cependant, la plupart des études à ce jour ont employées dont lignées cellulaires sont propriétaires (et donc pas largement disponibles), nécessitent des soins continus et de manipulation, ou les deux. En conséquence, la capacité de normaliser les protocoles, effectuer inter-laboratoires d'étalonnage des exercices, et, finalement, de transférer cette technologie de criblage pour les ressources en eau communautaire reste entravée.
Au moins un fournisseur de tests biologiques in vitro sélectionnés à travers le programme US ToxCast est disponible dans le commerce 13 facile à utiliser "gel et de dégel4; formats. Ces divisions arrêté de cellules "kits" ont été montré pour être robuste dans la mesure de l'activité des produits chimiques extraites de l' eau représentant différents niveaux de traitement 14. Bien que les protocoles du fournisseur sont disponibles pour cribler la bioactivité des composés chimiques ou des mélanges de certains d'entre eux doivent être modifiés avant qu'ils puissent être appliqués à des échantillons d'eau. Effluent traité des eaux usées 15, les eaux de ruissellement 16, les eaux réceptrices 17,18 et plus récemment recyclé 19,20 d'eau sont d' excellents exemples de milieux aqueux qui sont d'intérêt pour la communauté de la qualité de l' eau.
Cette étude présente un seul protocole standardisé pour mesurer l'activité du système endocrinien dans des échantillons d'eau à l' aide disponible dans le commerce, division arrêté en bioessais de transactivation in vitro. Nous avons démontré la robustesse du protocole par le biais d'une évaluation complète de fond, la réceptivité de la dose et la répétabilité de réponse pour two les effets particulièrement Estrogen d'intérêt et récepteur des glucocorticoïdes transactivation (ER et GR, respectivement). Le protocole a été appliqué à des échantillons d'écran de traitement des effluents des eaux usées et des eaux de surface des systèmes d'eau douce en Californie.
Protocol
Representative Results
Discussion
La puissance bien documenté des oestrogènes environnementaux, tels que 17β-estradiol (E2), garantit le dépistage de ces produits chimiques à ng / L concentrations 23,24. Dans cette étude, la réponse de l' urgence pour les effluents d'eaux usées (gamme BEQ: 2,3 à 17 ng E2 / L) était légèrement supérieur à celui rapporté pour l' effluent secondaire de WWTPs australiennes 20, alors que les BEQ pour l' eau de surface (<0,5 à 4 ng E2 / L ) étaient dans la plage rappor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
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