Screening für Endokrine Aktivität in Wasser unter Verwendung von handelsüblichen<em> In Vitro</em> Trans Biotests
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
In – vitro – Trans Biotests haben Versprechen als Wasserqualität Monitoring – Tools gezeigt, aber ihre Annahme und weit verbreitete Anwendung ist zum Teil auf einen Mangel an standardisierten Methoden und die Verfügbarkeit von robusten, benutzerfreundliche Technologie aufgrund behindert. In dieser Studie wurden im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelllinien wurden quantitativ verwendet für endokrine Aktivität zu screenen von Chemikalien, die in Wasserproben von Interesse für die Umweltqualität Profis. Ein einziges, standardisiertes Protokoll, das umfassende Qualitätssicherung / Qualitätskontrolle (QA / QC) Kontrollen einbezogen wurde für Östrogen- und Glucocorticoid-Rezeptor-Aktivität entwickelt (ER und GR, jeweils) unter Verwendung eines zellbasierten Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) -Test. Die Proben der behandelten kommunalen Abwasser Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien (USA), wurden unter Verwendung von Festphasenextraktion und analysiert für endokrine Aktivität extrahiert, um die standardisierten Proto mitcol. Hintergrund und Dosis-Wirkungs-für Endpunkt spezifische Referenz Chemikalien erfüllt QA / QC-Richtlinien für notwendig erachtet für eine zuverlässige Messung. Der Bioassay-Screening-Antwort für die Oberflächenwasserproben war weitgehend nicht nachweisbar. Im Gegensatz dazu hatte Abwasserproben aus sekundären Behandlungsanlagen die höchste messbare Aktivität, mit geschätzten Bioassay äquivalenten Konzentrationen (BEQs) bis zu 392 ng Dexamethason / L für GR und 17 ng 17β-Estradiol / L für ER. Der Bioassay Antwort für eine tertiäre Abwasserprobe war niedriger als die für sekundäre Abwässer gemessen, was auf eine geringere Rest von endokrin wirksamen Chemikalien nach vorheriger Behandlung. Dieses Protokoll hat gezeigt , dass in vitro – Trans Biotests , die im Handel erhältlich, divisions verhaftet Zelle "Kits" nutzen wollen , können für endokrine Aktivität in Wasser zu screenen angepasst werden.
Introduction
Aktuelle Überwachung der Wasserqualität auf der Fähigkeit sagt, genau und präzise das Auftreten von chemischen Verunreinigungen als Proxy für die Exposition gegenüber Mensch und Tier zu messen. Dies ist jedoch chemisch-by-chemische Überwachung und Beurteilung Paradigma kann nicht Schritt halten mit den sich ständig ändernden chemischen Universum, das wir konfrontiert sind. Wenn wir mehr über das Schicksal und Effekte von synthetischen und natürlichen Chemikalien lernen wir weiterhin für Messinstrumente zu suchen, die biologischen Auswirkungen zu erwarten Adresse und dass zur gleichen Zeit auf Veränderungen in der chemischen Produktion, Nutzung und Umwelt Eingang immun. Solche Werkzeuge sind besonders relevant für das Verständnis, ob unbekannte oder neue Chemikalien und Transformationsprodukte, unsere Aufmerksamkeit verdienen. Darüber hinaus komplexe Mischungen von Chemikalien, die in Wasser schlecht durch einzelne chemische Überwachung angesprochen. So stehen wir vor der Herausforderung, die bestehenden Überwachungs Toolbox besser Adresse zu modernisieren, diese Probleme in Oberflächengewässern that Einleitung von gereinigtem Abwasser anfällt und städtischen / Abfluss von Regenwasser erhalten.
In den letzten Jahren haben Bioanalysetechniken versprechen als Screening-Instrumente gezeigt für die Wasserqualitätsbeurteilung. Insbesondere in'vitro Biotests, die Chemikalien wirken über bekannte, spezifische Wirkungsweisen 1,2 sind von großem Interesse für die Umweltüberwachung Gemeinschaft 3 reagieren. Zahlreiche Untersuchungen haben in vitro Biotests eingesetzt , um die endokrine Wirkung von Trink-, Oberflächen- und Abwasser 4 -6 zu quantifizieren. Außerdem zielen eine Reihe von Biotests Molekular auslösenden Ereignissen (beispielsweise Rezeptoraktivierung) , die möglicherweise zu nachteiligen Wirkungen über adverse outcome pathway 7,8 analysiert verknüpft werden können.
Die Entwicklung der bioscreening für die Wasserqualitätsbewertung hat relativ schnell gewesen, mit Hunderten von verschiedenen in vitro – Bioassay Endpunkte wurden ausgewertet haben ihreDienstprogramm 9,10. Derzeit ist nur eine Handvoll von Biotests wurden gute Messgenauigkeit zu erreichen , gezeigt (in Laboratorien) , während die Fähigkeit , unter Wasserqualitäten 5,6 zu unterscheiden demonstrieren. Für behandeltem Abwasser insbesondere das Auftreten von Östrogenen und Glukokortikoid Steroide wurde für die Verwendung von In – vitro – Transaktivierungsassays 11,12 erfolgreich bilanziert. Allerdings haben die meisten Studien bisher eingesetzten Biotests, deren Zelllinien sind Eigentum der Firma (und somit nicht allgemein verfügbar), bedürfen ständiger Pflege und Manipulation, oder beides. Als Ergebnis wird die Fähigkeit, Protokolle zu standardisieren, führen inter-Laborkalibrierung Übungen und schließlich diese Screening-Technologie, um die Wasserressourcen zu übertragen Gemeinschaft gehinderten bleibt.
Mindestens ein Anbieter von In – vitro – Biotests durch die US ToxCast Programm überprüft , ist im Handel erhältlich 13 in leicht zu bedienen "Einfrieren und Auftauen4; Formate. Diese Abteilung verhaftet Zelle "Kits" wurden bei der Messung der Aktivität von Chemikalien aus dem Wasser , die verschiedene Ebenen der Behandlung 14 extrahiert werden robust gezeigt. Obwohl Anbieter Protokolle die Bioaktivität von einzelnen Chemikalien oder Mischungen zum Screenen verfügbar sind, erfordern einige von ihnen Modifikation, bevor sie an Wasserproben angewendet werden. Behandeltem Abwasser 15, Abfluss von Regenwasser 16, Vorfluter 17,18 und in jüngster Zeit wieder aufbereitetem Wasser 19,20 sind Paradebeispiele für wässrige Medien , die von Interesse für die Wasserqualität Gemeinschaft sind.
Diese Studie stellt eine einheitliche, standardisierte Protokoll , um die endokrine Aktivität in Wasserproben unter Verwendung von kommerziell erhältlichen, divisions verhaftet in vitro Trans Biotests zu messen. Wir haben gezeigt, Robustheit des Protokolls durch eine umfassende Bewertung der Hintergrund, Dosis Responsivität und Wiederholbarkeit der Reaktion für two Endpunkte von besonderem Interesse Estrogen und Glucocorticoidrezeptor Trans (ER und GR, beziehungsweise). Das Protokoll wurde auf Bildschirm Proben von behandeltem Abwasser und Oberflächenwasser von Süßwassersystemen in Kalifornien angewendet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die gut dokumentierte Potenz von Umwelt Estrogene, wie 17β-Estradiol (E2), garantiert Screening für diese Chemikalien in ng / L – Konzentrationen 23,24. In dieser Studie wurde die ER – Antwort für Abwasser Abwässer (BEQ Bereich: 2,3 bis 17 ng E2 / L) war etwas höher als für sekundäre Abwasser berichtet von der australischen AWBAn 20, während die BEQs für Oberflächenwasser (<0,5 bis 4 ng E2 / L ) waren für die Oberflächen- und Regenwasser im Bereich an anderer Stelle berichtet (<1 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. . Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). . Direct potable reuse: a path forward. , (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
