الكشف عن آخر الغدد الصماء في المياه عن طريق المتاحة تجاريا<em> في المختبر</em> Transactivation اختبارات بيولوجية
Summary
A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Abstract
في اختبارات بيولوجية transactivation المختبر أظهرت وعد كأدوات مراقبة نوعية المياه، لكن اعتمادها وتطبيقها على نطاق واسع وعرقل ويرجع ذلك جزئيا إلى عدم وجود طرق موحدة وتوفر تكنولوجيا قوية وسهلة الاستخدام. في هذه الدراسة، كانوا يعملون المتاحة تجاريا، وخطوط الخلايا القبض تقسيم للكشف كمي للنشاط الغدد الصماء من المواد الكيميائية الموجودة في عينات المياه التي تهم المهنيين جودة البيئة. A، بروتوكول موحد واحد التي شملت ضمان الجودة الشاملة / مراقبة الجودة تم تطوير (QA / QC) الشيكات للنشاط الاستروجين وجلايكورتيكود مستقبلات (ER وGR، على التوالي) باستخدام فحص خلية القاعدة نقل الإسفار الرنين الطاقة (الحنق). عينات من المياه المعالجة مياه الصرف الصحي البلدية والمياه السطحية من نظم المياه العذبة في ولاية كاليفورنيا (الولايات المتحدة الأمريكية) واستخراج، وذلك باستخدام الاستخلاص في الطور الصلب وتحليلها لنشاط الغدد الصماء باستخدام بروتو موحدالعقيد. اجتمع الخلفية والجرعة والاستجابة للمواد الكيميائية مرجعية نقطة النهاية المحددة المبادئ التوجيهية QA / QC تعتبر ضرورية لقياس موثوق بها. وكان الرد الأحيائي لفحص عينات المياه السطحية إلى حد كبير لا يمكن اكتشافها. في المقابل، كان عينات النفايات السائلة من محطات المعالجة الثانوية أعلى نشاط للقياس، مع تركيز يعادل الأحيائي التقديري (BEQs) ما يصل إلى 392 نانوغرام ديكساميثازون / L ل GR و 17 نانوغرام 17β استراديول / L لER. وكان الرد الأحيائي لعينة مياه الصرف التعليم العالي أقل من أن قياس لمياه الصرف الثانوية، مما يشير إلى المتبقية أقل من المواد الكيميائية الغدد الصماء نشطة بعد العلاج المتقدمة. وأظهر هذا البروتوكول أنه في اختبارات بيولوجية transactivation المختبر التي تستخدم المتاحة تجاريا، خلية القبض تقسيم "مجموعات"، يمكن تكييفها للكشف عن نشاط الغدد الصماء في الماء.
Introduction
ويستند مراقبة جودة المياه الحالية على القدرة على قياس بدقة وعلى وجه التحديد وقوع الملوثات الكيميائية، وكيل التعرض للحياة البرية والبشر. ومع ذلك، هذا الرصد الكيميائي من قبل والكيميائية ونموذج التقييم لا يمكن مواكبة الكون الكيميائية المتغيرة باستمرار التي نواجهها. ونحن نتعلم المزيد عن مصير وآثار المواد الكيميائية الاصطناعية والطبيعية، ونحن نواصل البحث عن أدوات القياس التي تعالج المتوقع التأثيرات البيولوجية، والتي في نفس الوقت ليست محصنة ضد التغيرات في إنتاج المواد الكيميائية واستخدام ومدخلات بيئية. هذه الأدوات هي ذات الصلة وخاصة لفهم ما إذا كانت المواد الكيميائية غير معروفة أو جديدة، ومنتجات التحول، تستحق اهتمامنا. وعلاوة على ذلك، يتم تناول خليط معقد من المواد الكيميائية الموجودة في المياه سيئة من قبل رصد الكيميائي الفردية. وبالتالي، فإننا نواجه التحدي المتمثل في تحديث الأدوات الرصد القائمة إلى عنوان أفضل هذه القضايا في المياه السطحية ثار الحصول تصريف المياه العادمة المعالجة والحضر جريان المياه / مياه الأمطار.
في السنوات الأخيرة، وقد أظهرت تقنيات bioanalytical وعد كأدوات فحص لتقييم نوعية المياه. وعلى وجه الخصوص، اختبارات بيولوجية in'vitro التي تستجيب للمواد الكيميائية التي تعمل عبر معروفة، وطرق عمل محددة 1،2 ذات أهمية كبيرة للمجتمع الرصد البيئي 3. وقد استخدمت العديد من التحقيقات في اختبارات بيولوجية في المختبر لقياس النشاط الغدد الصماء من الشرب، والمياه السطحية ومياه الصرف الصحي 4 -6. وعلاوة على ذلك، هناك عدد من اختبارات بيولوجية تستهدف أحداث الشروع الجزيئية (على سبيل المثال، تنشيط مستقبلات) التي يحتمل أن تكون مرتبطة الآثار الضارة عبر مسار نتائج سلبية يحلل 7،8.
وقد تطور bioscreening لتقييم نوعية المياه سريع نسبيا، مع مئات من مختلف في النهاية الأحيائي المختبر بعد أن تم تقييمها الخاصة بهمفائدة 9،10. حاليا، وقد ثبت سوى عدد قليل من اختبارات بيولوجية لتحقيق الدقة قياس جيدة (داخل المختبرات)، في حين يدل على القدرة على التفريق بين نوعية المياه 5،6. للالمياه العادمة المعالجة على وجه الخصوص، كان وقوع هرمون الاستروجين والمنشطات القشرية السكرية بنجاح شكلت للاستخدام في فحوصات المختبر transactivation 11،12. اختبارات بيولوجية ومع ذلك، فإن معظم الدراسات حتى الآن قد استخدمت الذين خلية خطوط هي ملكية (وبالتالي غير متوفرة على نطاق واسع)، وتتطلب عناية مستمرة والتلاعب، أو كليهما. ونتيجة لذلك، فإن القدرة على توحيد بروتوكولات، وأداء تمارين المعايرة بين المختبرات، وفي نهاية المطاف لنقل هذه التكنولوجيا للفحص لموارد المياه لا يزال المجتمع حال دون.
مورد واحد على الأقل في المختبر اختبارات بيولوجية فحصها من خلال برنامج ToxCast الولايات المتحدة متاح تجاريا 13 في سهلة الاستخدام "التجميد والذوبان4؛ الأشكال. وقد تبين أن هذه الخلايا "مجموعات" اعتقل تقسيم لتكون قوية في قياس نشاط المواد الكيميائية المستخرجة من المياه تمثل مستويات مختلفة من العلاج 14. وعلى الرغم من بروتوكولات بائع المتاحة لفحص النشاط الحيوي للمواد الكيميائية الفردية أو خليط، وبعضها يتطلب تعديل قبل أن يمكن تطبيقها على عينات من المياه. يعالج المياه العادمة 15، جريان مياه الأمطار 16، وتلقي مياه 17،18 وأكثر المعاد تدويرها مؤخرا 19،20 المياه من أفضل الأمثلة على الأوساط المائية التي تهم المجتمع نوعية المياه.
تقدم هذه الدراسة واحدة، بروتوكول موحد لقياس النشاط الغدد الصماء في عينات المياه باستخدام المتاحة تجاريا، تقسيم اعتقل في اختبارات بيولوجية transactivation المختبر. أثبتنا متانة البروتوكول من خلال إجراء تقييم شامل للخلفية، responsivity الجرعة وتكرار الاستجابة لطوماس فيبسالنهاية يا من معين الاستروجين الفائدة وجلايكورتيكود مستقبلات transactivation (ER وGR، على التوالي). تم تطبيق بروتوكول لعينات الشاشة من المياه العادمة المعالجة والمياه السطحية من نظم المياه العذبة في ولاية كاليفورنيا.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقوة موثقة جيدا من هرمون الاستروجين البيئية، مثل 17β استراديول (E2)، مذكرات الكشف عن هذه المواد الكيميائية في نانوغرام تركيزات / L 23،24. في هذه الدراسة، واستجابة ER عن المياه المستعملة (المدى بيك: 2،3 حتي 17 نانوغرام E2 / L) كان أعلى إلى حد ما مما ذكر عن النفايات السائلة ال…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
Materials
| GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
| PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
| Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
| Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
| Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
| Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
| Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
| 17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
| Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
| Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
| Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
| Class II biological safety cabinet | Various* | ||
| CO2 incubator | Various* | ||
| Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
| Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
| * No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. | |||
References
- Dix, D. J., Houck, K. A., Martin, M. T., Richard, M. A., Setzer, R. W., Kavlock, R. J. The ToxCast program for prioritizing toxicity testing of environmental chemicals. Toxicol. Sci. 95 (1), 5-12 (2007).
- Reif, D. M., et al. Endocrine profiling and prioritization of environmental chemicals using ToxCast data. Environ. Health Perspect. 118 (12), 1714-1720 (2010).
- Maruya, K. A., et al. A tiered, integrated biological and chemical monitoring framework for contaminants of emerging concern (CECs) in aquatic ecosystems. Integr. Environ. Assess. Manag. , (2015).
- Van der Linden, S. C., et al. Detection of multiple hormonal activities in wastewater effluents, surface water, using a panel of steroid receptor CALUX bioassays. Environ. Sci. Technol. 42 (15), 5814-5820 (2008).
- Leusch, F. D. L., et al. Comparison of five in vitro bioassays to measure estrogenic activity in environmental waters. Environ. Sci. Technol. 44 (10), 3853-3860 (2010).
- Jarosova, B., et al. Europe-wide survey of estrogenicity in wastewater treatment plant effluents: the need for effect-based monitoring. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (18), 10970-10982 (2014).
- Sonneveld, E., et al. Comparison of in vitro and in vivo screening models for androgenic and estrogenic activities. Toxicol. Sci. 89 (1), 173-187 (2006).
- Piersma, A. H., et al. Evaluation of an alternative in vitro test battery for detecting reproductive toxicants. Reprod. Toxicol. 38, 53-64 (2013).
- Escher, B. I., et al. Benchmarking organic micropollutants in wastewater, recycled water and drinking water with in vitro bioassays. Environ. Sci. Technol. 48 (3), 1940-1956 (2014).
- U.S. Environmental Protection Agency (USEPA) Endocrine Disruptor Screening Program. . Prioritization of the endocrine disruptor screening program universe of chemicals for an estrogen receptor adverse outcome pathway using computational toxicology tools. , (2012).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of wastewater and recycled water quality: a comparison of lines of evidence from in vitro, in vivo and chemical analyses. Water Res. 50, 420-431 (2014).
- Jia, A., Wu, S., Daniels, K. D., Snyder, S. A. Balancing the budget: accounting for glucocorticoid bioactivity and fate during water treatment. Environ. Sci. Technol. 50 (6), 2870-2880 (2016).
- Huang, R., et al. Chemical genomics profiling of environmental chemical modulation of human nuclear receptors. Environ. Health Perspect. 119 (8), 1142-1148 (2011).
- Mehinto, A. C., et al. Interlaboratory comparison of in vitro bioassays for screening of endocrine active chemicals in recycled water. Water Res. 83, 303-309 (2015).
- Ternes, T. A., Joss, A., Siegrist, H. Scrutinizing pharmaceuticals and personal care products in wastewater treatment. Environ. Sci. Technol. 38 (20), 392A-399A (2004).
- Tang, J. Y. M., et al. Toxicity characterization of urban stormwater with bioanalytical tools. Water Res. 47, 5594-5606 (2013).
- Scott, P. D., et al. An assessment of endocrine activity in Australian rivers using chemical and in vitro analyses. Environ. Sci. Pollut. Res. 21 (22), 12951-12967 (2014).
- Vidal-Dorsch, D. E., Bay, S. M., Maruya, K., Snyder, S. A., Trenholm, R. A., Vanderford, B. J. Contaminants of emerging concern in municipal wastewater effluents and marine receiving water. Environ. Toxicol. Chem. 31 (12), 2674-2682 (2012).
- WateReuse Research Foundation (WRRF). . Direct potable reuse: a path forward. , (2011).
- Leusch, F. D. L., et al. Assessment of the application of bioanalytical tools as surrogate measure of chemical contaminants in recycled water. Water Res. 49, 300-315 (2014).
- Schriks, M., et al. Occurrence of glucocorticoid activity in various surface waters in the Netherlands. Chemosphere. 93 (2), 450-454 (2013).
- Suzuki, G., Sato, K., Isobe, T., Takigami, H., Brouwer, A., Nakayama, K. Detection of glucocorticoid receptor agonist in effluents from sewage treatment plants in Japan. Sci. Tot. Environ. 527-528, 328-334 (2015).
- Purdom, C. E., Hardiman, P. A., Byea, V. V. J., Enoa, N. C., Tyler, C. R., Sumpter, J. P. Estrogenic effects of effluents from sewage treatment works. Chemistry and Ecology. 8 (4), 275-285 (1994).
- Kidd, K. A., et al. Collapse of a fish population after exposure to a synthetic estrogen. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (21), 8897-8901 (2007).
- Kojima, H., Katsura, E., Takeuchi, S., Niiyama, K., Kobayashi, K. Screening of estrogen and androgen receptor activities in 200 pesticides by in vitro reporter gene assays using Chinese hamster ovary cells. Environ. Health Perspect. 112 (5), 524-531 (2004).
- Kugathas, S., Sumpter, J. P. Synthetic glucocorticoids in the environment: First results on their potential impacts on fish. Environ. Sci. Technol. 45, 2377-2383 (2011).
- Van der Linden, S. C., et al. Development of a panel of high-throughput reporter-gene assays to detect genotoxicity and oxidative stress. Mutat. Res. Genet. Toxicol. Environ. Mutagen. 760, 23-32 (2014).
- Cwiertny, D. M., Snyder, S. A., Schlenk, D., Kolodziej, E. P. Environmental designer drugs: when transformation may not eliminate risk. Environ. Sci. Technol. 48, 11737-11745 (2014).
