A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested (“freeze and thaw”) in vitro transactivation bioassays.
Nel test biologici transattivazione in vitro hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di monitoraggio della qualità delle acque, ma la loro adozione e l'applicazione diffusa è stata ostacolata in parte a causa della mancanza di metodi e disponibilità di robusta, tecnologia user-friendly standardizzati. In questo studio, disponibili in commercio, linee cellulari di divisione-arrestati sono stati impiegati per lo screening quantitativo per l'attività endocrina di sostanze chimiche presenti nei campioni di acqua di interesse per i professionisti di qualità ambientale. Un unico, protocollo standardizzato che comprendeva garanzia della qualità / controllo della qualità (QA / QC) controlli è stato sviluppato per l'attività degli estrogeni e glucocorticoidi recettore (ER e GR, rispettivamente) con un saggio basato su cellule Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET). I campioni di trattamento degli effluenti acque reflue urbane e delle acque di superficie dai sistemi di acqua dolce in California (USA), sono stati estratti con estrazione in fase solida e analizzati per l'attività endocrina utilizzando il proto standardizzatocol. Background e dose-risposta per le sostanze chimiche di riferimento specifici per endpoint soddisfatte le linee guida QA / QC ritenute necessarie per la misurazione affidabile. La risposta di screening test biologico per i campioni d'acqua di superficie non era in gran parte rilevabile. Al contrario, i campioni effluenti degli impianti di trattamento secondario hanno avuto la più alta attività misurabile, con concentrazioni equivalenti stimata saggi biologici (BEQ) fino a 392 ng desametasone / L per GR e 17 ng 17β-estradiolo / L per ER. La risposta saggio biologico per un campione effluente terziaria era inferiore a quello misurato per effluenti secondari, che indica un residuo inferiore di sostanze chimiche attive a livello endocrino dopo il trattamento avanzato. Questo protocollo ha dimostrato che nei biotest transattivazione vitro che utilizzano disponibili in commercio, Divisione cellulare-arrestato "kit", può essere adattato per lo screening per l'attività endocrina in acqua.
monitoraggio della qualità dell'acqua corrente si basa sulla capacità di misurare con precisione e con precisione la presenza di contaminanti chimici come proxy per l'esposizione per la fauna selvatica e gli esseri umani. Tuttavia, questo monitoraggio chimico-by-chimiche e paradigma di valutazione non può tenere il passo con la continua evoluzione dell'universo chimico che abbiamo di fronte. Come impariamo di più sul destino e gli effetti delle sostanze chimiche di sintesi e naturali, continuiamo a cercare strumenti di misurazione che si rivolgono attesi impatti biologici, e che allo stesso tempo sono immuni da cambiamenti nella produzione di prodotti chimici, l'utilizzo e l'ingresso ambientale. Tali strumenti sono particolarmente rilevanti per la comprensione se sconosciute o nuove sostanze chimiche e prodotti di trasformazione, meritano la nostra attenzione. Inoltre, miscele complesse di sostanze chimiche presenti nell'acqua sono scarsamente affrontate da monitoraggio chimico individuale. Così, ci troviamo di fronte alla sfida di modernizzazione degli strumenti di monitoraggio esistente per affrontare meglio questi problemi nelle acque superficiali that ricevere scarico degli effluenti acque reflue trattate e deflusso / acque piovane urbane.
Negli ultimi anni, le tecniche bioanalitici hanno mostrato risultati promettenti come strumenti di screening per la valutazione della qualità delle acque. In particolare, biotest in'vitro che rispondono alle sostanze chimiche che agiscono tramite noto, i modi d'azione specifici 1,2 sono di grande interesse per la comunità monitoraggio ambientale 3. Numerose indagini hanno impiegato in test biologici in vitro per quantificare l'attività endocrina di bere, di superficie e acque di scarico 4 -6. Inoltre, una serie di saggi biologici bersaglio eventi scatenanti molecolari (ad esempio, il recettore di attivazione) che potenzialmente possono essere associati ad effetti deleteri via via negativo esito analisi 7,8.
L'evoluzione della bioscreening per la valutazione della qualità delle acque è stato relativamente rapido, con centinaia di diverso in endpoint saggi biologici in vitro sono state esaminate per la loroutility 9,10. Attualmente, solo una manciata di test biologici hanno dimostrato di ottenere una buona precisione di misura (nei laboratori), dimostrando la capacità di differenziare tra qualità dell'acqua 5,6. Per effluenti acque reflue trattate, in particolare, la presenza di estrogeni e steroidi glucocorticoidi è stata valutata con successo nei test in vitro di transattivazione 11,12. test biologici Tuttavia, la maggior parte degli studi fino ad oggi hanno dipendenti la cui cella linee sono di proprietà (e quindi non largamente disponibile), necessitano di cure continue e di manipolazione, o entrambi. Di conseguenza, la capacità di standardizzare i protocolli, eseguire interlaboratorio esercizi di calibrazione, e in ultima analisi, di trasferire questa tecnologia di screening per le risorse idriche della comunità rimane ostacolato.
Almeno un fornitore di test biologici in vitro controllati attraverso il programma degli Stati Uniti ToxCast è disponibile in commercio in 13 facili da usare "gelo e disgelo4; formati. Queste cellule "kit" di divisione-arrestati hanno dimostrato di essere robusto in misurando l'attività di sostanze chimiche estratte dall'acqua che rappresentano diversi livelli di trattamento 14. Sebbene i protocolli vendor sono disponibili per schermare la bioattività di singoli prodotti chimici o miscele, alcuni di essi richiedono la modifica prima che possano essere applicati a campioni di acqua. Trattata acque reflue effluenti 15, deflusso delle acque piovane 16, ricevendo le acque 17,18 e, più recentemente riciclato 19,20 acqua sono i principali esempi di mezzi acquosi che sono di interesse per la comunità della qualità delle acque.
Questo studio presenta un unico protocollo standardizzato per misurare l'attività endocrina in campioni di acqua utilizzando disponibili in commercio, divisione arrestato in saggi biologici transattivazione vitro. Abbiamo dimostrato la robustezza del protocollo attraverso una valutazione globale di sfondo, responsività dose e la ripetibilità di risposta per twO endpoint di particolare interesse e di estrogeni glucocorticoidi recettore transattivazione (ER e GR, rispettivamente). Il protocollo è stato applicato a campioni dello schermo di effluenti acque reflue trattate e delle acque di superficie dai sistemi d'acqua dolce in California.
La potenza ben documentata di estrogeni ambientali, come 17β-estradiolo (E2), lo screening mandati di queste sostanze chimiche in ng / L concentrazioni 23,24. In questo studio, la risposta ER per gli effluenti di acque reflue (gamma BEQ: 2,3-17 ng E2 / L) era un po 'superiore a quello riportato per effluente secondario da WWTPs australiani 20, mentre i BEQ per le acque superficiali (<0,5 a 4 ng E2 / L ) erano nel range riportato per superficie e delle acque piovane altrove (<1 a 11 ng E2…
The authors have nothing to disclose.
Funding was provided by State Water Resources Control Board (Agreements No. 10-096-250 and 14-090-270). We thank S. Abbasi, M. Connor, S. Engelage, K. North, J. Armstrong, S. Asato, M. Dojiri, D. Schlenk, S. Snyder, S. Westerheide, B. Escher, F. Leusch, G. Pelanek, K. Bi, and J. Printen. The authors declare no conflict of interest, and reference to trade names does not imply endorsement.
GeneBLAzer ER alpha DA assay kit | ThermoFisher | K1393 | Kit includes ER division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
GeneBLAzer GR DA assay kit | ThermoFisher | K1391 | Kit includes GR division arrested (DA) cells and LiveBLAzer FRET loading kit. |
PrestoBlue cell viability reagent | ThermoFisher | A-13261 | |
Trypan blue, 0.4% in PBS | Sigma-Aldrich | T8154 | Also available at ThermoFisher |
Corning 96 well black wall, clear-bottom plate | Corning | 3603 | Individually wrapped, sterile with lid |
Whatman glass fiber filters, GF/A, 1.6 µM | Sigma-Aldrich | WHA1820025 | |
Microplate aluminum sealing film | E&K Scientific | T592100 | |
Oasis HLB 6 cc cartridge, 200 mg sorbent | Waters | WAT106202 | |
17β Estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | CAS #50-28-2 |
Ascorbic acid | Fisher Scientific | A61-100 | Also available at Sigma-Aldrich |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D4902 | CAS #50-02-2 |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Molecular grade |
Solvents (acetone, hexane, methanol) | Fisher Scientific | HPLC grade | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Chemical is highly toxic and must be handled with caution. Use protective clothing and weigh under a fumehood. Also available at EMD Millipore. |
Automated cell counter or hemocytometer | Various* | Suppliers include Bio-Rad, Fisher Scientific, Sigma-Aldrich and ThermoFisher. | |
Class II biological safety cabinet | Various* | ||
CO2 incubator | Various* | ||
Cryogenic freezer | Various* | Liquid nitrogen storage dewar is recommended. | |
Fluorescence microplate reader | Various* | The reader must have bottom read capabilities. | |
* No recommended source, the choice of this equipment depends on budget, frequency of use, and lab space. |