Summary

La visualización de IL-22 que expresan linfocitos utilizando ratones Reporter

Published: January 25, 2017
doi:

Summary

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Abstract

reportero ratones han sido ampliamente utilizados para observar la localización de la expresión de determinados genes. Este protocolo se centra en una estrategia para establecer un nuevo modelo de ratón transgénico reportero. Elegimos para visualizar la expresión de genes de interleucina (IL) 22, porque esta citocina tiene actividades importantes en el intestino, donde contribuye a reparar los tejidos dañados por la inflamación. Los sistemas indicadores ofrecen considerables ventajas sobre otros métodos de identificación de productos en vivo. En el caso de IL-22, otros estudios habían aislado primero las células de los tejidos y luego se volvieron a estimular las células in vitro. IL-22, que normalmente se secreta, estaba atrapado dentro de las células usando un fármaco, y la tinción intracelular se utiliza para visualizar la misma. Este método identifica células capaces de producir IL-22, pero no determina si lo hacían en vivo. El diseño reportero incluye la inserción de un gen de una proteína fluorescente (tdTomato) en el gen IL-22 en un wa talesy que la proteína fluorescente no puede ser secretada y por lo tanto permanece atrapado dentro de las células productoras en vivo. Productores fluorescentes pueden ser visualizados en secciones de tejido o por análisis ex vivo a través de citometría de flujo. El proceso de construcción real para el reportero incluido recombinería un cromosoma artificial bacteriano que contenía el gen de IL-22. Se introdujo entonces este cromosoma por ingeniería genética en el genoma del ratón. IL-22 expresión reportero homeostático se observó en diferentes tejidos de ratón, incluyendo el bazo, timo, ganglios linfáticos, placas de Peyer, y el intestino, por citometría de flujo análisis. La colitis se indujo mediante la transferencia de células T (CD4 + CD45RBhigh), y la expresión del indicador se visualizó. células T positivos fueron primero presente en los ganglios linfáticos mesentéricos, y luego se acumulan dentro de la lámina propia de los pequeños tejidos delgado y el colon distal. La estrategia de usar BAC dio expresión del indicador buena fidelidad en comparación con IL-22 expresSion, y es más simple que los procedimientos de knock-in.

Introduction

Celular de expresión de tipo específico de genes informadores es útil para identificar células que expresan activamente el objetivo en los tejidos debajo de estados homeostáticos y perturbados. También permite la purificación de estas células, que se mantienen viables, para estudiar sus otras propiedades. reportero ratones se han utilizado para elucidar el mecanismo de acción de citoquinas específicas, factores de transcripción, y elementos reguladores. Estrategias anteriores 1, 2, 3 se han basado en gran medida en golpear el reportero en el locus diana en el cromosoma de ratón, un procedimiento que consume tiempo y costoso. Por lo tanto, un método más simple para la generación de ratones reportero es deseable.

Las citoquinas son una amplia clase de pequeñas, proteínas secretadas / péptidos que regulan la respuesta inmune a través de la señalización intercelular. La interleucina 22 (IL-22) es una citoquina con muchas actividades reportados, incluyendo fu barreranción, reparación de tejidos, la inflamación y 4. Aunque la IL-22 se descubrió inicialmente como un producto de las células T 5, los informes posteriores demostraron su expresión en las células asesinas naturales (NK) en los seres humanos y los ratones 6 7 y en otras clases de linfocitos innatas 8. A pesar de una extensa observación de las células productoras-22 IL, visualización de la IL-22 se requería previamente la estimulación ex vivo y permeabilización a las manchas con anticuerpos. Por lo tanto, la novela de IL-22 reportero ratones serían una herramienta muy útil para investigar la función de IL-22 en los procesos homeostáticos y patógenos.

Aquí, hemos desarrollado un modelo de ratón transgénico reportero simplificada para observar las células IL-22-que producen in vivo e in vitro. El uso de un método de BAC recombinería 9, insertamos la secuencia de ADNc tdTomato con poli A fragmentos de señal en el loc IL-22nosotros y reemplazado exón 1. Las otras regiones, los exones, y elementos reguladores sin traducir no fueron perturbados, ya que nos gustaría imitar la regulación natural de la IL-22 tanto como sea posible. El sitio de inserción reportero interrumpe la secuencia señal, lo que resulta en la acumulación de la reportera en el interior de las células que producen, a diferencia de IL-22 en sí, que es secretada rápidamente. Este nuevo método puede aplicarse también a la generación de ratones reportero de otras proteínas secretadas.

Protocol

Todos los animales recibieron la atención adecuada de acuerdo con los procedimientos experimentales descritos en la Guía 2011 para Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio Comité del Laboratorio Nacional de Investigación del Cáncer de Frederick. 1. Generación de IL-22-tdTomato reportero ratones por BAC Recombinería NOTA: Los ratones deben estar inconsciente y no se mueven en respuesta a un estímulo nocivo. Esterilizar el área quirúrgica con 70% de etanol …

Representative Results

A murino IL-22 transgén reportero se ha creado usando recombinería para modificar un cromosoma artificial bacteriano que lleva el locus de IL-22. La figura 1 muestra un diagrama de vector que contiene el gen pBACe3.6 sacBII, un marcador de selección de positivo, y el gen de resistencia a cloranfenicol antibiótico 11. Después de la introducción de tdTomato en el exón 1, la secuencia de péptido señal fue interrumpido, como se muest…

Discussion

IL-22 juega un papel esencial en la defensa innata y tejido huésped remodelación. Células-22 productoras de IL han identificado ex vivo mediante tinción intracelular. Sin embargo, sigue siendo difícil de rastrear la expresión de IL-22 in situ, ya sea en el estado normal o en condiciones inflamatorias. Este protocolo describe un nuevo método para desarrollar un IL-22 reportero modelo de ratón, lo que nos permite localizar las células indicadoras que expresan in vivo. El gen informador …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

Materials

RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

References

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Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

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