ויזואליזציה של לימפוציטים-22-להביע IL באמצעות עכברים Reporter
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
עכברי Reporter היו בשימוש נרחב כדי לבחון את הלוקליזציה של ביטוי של גנים ממוקדים. פרוטוקול זה מתמקד אסטרטגיה לבסס מודל עכבר כתב המהונדס חדש. בחרנו לדמיין interleukin (IL) ביטוי גנים 22 כי ציטוקינים זה יש פעילויות חשובות במעי, שם הוא תורם לתקן רקמות שנפגעו על ידי דלקת. מערכות Reporter להציע יתרונות משמעותיים על פני שיטות אחרות של זיהוי מוצרי in vivo. במקרה של IL-22, מחקרים אחרים בודדים לראשונה תאים מרקמות ולאחר מכן מחדש עוררו את התאים במבחנה. IL-22, אשר מופרש בדרך כלל, היה לכוד בתוך התאים באמצעות תרופה, והכתים תאיים שימש לדמיין את הדברים. שיטה זו מזהה תאים מסוגלים לייצר IL-22, אבל זה לא לקבוע אם הם עושים כל כך in vivo. עיצוב הכתב כולל החדרת גן חלבון פלואורסצנטי (tdTomato) לתוך גן IL-22 בתוך wa כזהy כי חלבון פלואורסצנטי לא יכול להיות מופרשים ולכן נשארה לכודה בתוך התאים המייצרים in vivo. המפיקים פלורסנט ניתן דמיינו מכן בסעיפים רקמות או על ידי ניתוח vivo לשעבר באמצעות cytometry הזרימה. תהליך הבנייה בפועל עבור הכתב כלולים recombineering כרומוזום בקטריאלי מלאכותי שהכיל את הגן IL-22. כרומוזום מהונדס זה אז הוכנס גנום העכבר. ביטוי כתב ההומיאוסטטית IL-22 נצפה ברקמות עכבר שונות, כולל הטחול, התימוס, בלוטות הלימפה, התיקון של Peyer ומעי, על ידי ניתוח תזרים cytometry. קוליטיס הושר על ידי תאי T (CD4 + CD45RBhigh) העברה, וביטוי כתב היה דמיין. T תאים חיוביים נוכחים ראשונים הבלוטות לימפה mesenteric, ולאחר מכן הם שהצטברו בתוך שכבת הרירית המיוחדת של רקמות מעי גסות הדיסטלי הקטנות. האסטרטגיה באמצעות BACS נתנה ביטוי כתב-נאמנות טובה לעומת IL-22 הבעהשיאון, וזה פשוט יותר מאשר נהלים עקומים.
Introduction
סוג ספציפי ביטוי נייד של גני כתב שימושי כדי לזהות תאים פעילים המבטאים את היעד ברקמות תחת מדינות ההומיאוסטטית ומודאגות. זה גם מאפשר הטיהור של תאים אלה, אשר נשארים קיימא, ללמוד נכסים הנוספים שלהם. עכברי כתב כבר נוצלו הבהרת מנגנון הפעולה עבור ציטוקינים ספציפיים, גורמי שעתוק, ואלמנטים רגולטוריים. אסטרטגיות קודמות 1, 2, 3 הסתמכו בעיקר על דפיקות הכתב לתוך מוקד יעד כרומוזום העכבר, הליך זמן רב ויקר. לפיכך, שיטה פשוטה עבור הדור של עכברי כתב רצויה.
ציטוקינים הם מעמד רחב של חלבונים קטנים, מופרש / פפטידים המווסתים את התגובה החיסונית באמצעות איתות אינטר. Interleukin 22 (IL-22) הוא ציטוקין עם רבים דיווחו פעילויות, כולל מחסום פוnction, תיקון רקמות, ודלקת 4. למרות IL-22 התגלה בתחילה כמוצר T-cell 5, דוחות שלאחר מכן הפגינו ביטויו הרג טבעיים (NK) תאים בבני אדם 6 ועכברים 7 ו בסוגים אחרים של לימפוציטים מולד 8. למרות תצפית נרחבת של תאי-22-ייצור IL, ויזואליזציה של IL-22 בעבר נדרש vivo לשעבר גירוי permeabilization בפני כתמים עם נוגדנים. לכן, רומן IL-22 עכברים הכתב יהיה כלי מאוד שימושי כדי לחקור את הפונקציה של IL-22 בתהליכים ההומיאוסטטית ו פתוגניים.
הנה, פתחנו מודל עכבר כתב מהונדס פשוט לשמור על IL-22-ייצור תאי in vivo ו במבחנה. באמצעות שיטה BAC recombineering 9, הכנסנו את רצף cDNA tdTomato עם פולי שברי אות לתוך loc IL-22לנו והחלפתי אקסון 1. האזורים המתורגמים האחרים, אקסונים, והאלמנטים רגולטוריים לא היו מוטרדים, מאז שהיינו רוצים לחקות את הוויסות הטבעית של IL-22 ככל האפשר. האתר של החדרת הכתב משבש את רצף האות, וכתוצאה מכך הצטברות של הכתב בתוך התאים המייצרים, בניגוד IL-22 עצמו, אשר מופרש במהירות. שיטה חדשה זו יכולה לחול גם על הדור של עכברי כתב חלבונים מופרשים אחרים.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 ממלאים תפקיד חיוני שיפוץ רקמות הגנת מארחת מולד. תאי IL-מייצר 22 זוהו לשעבר vivo על ידי מכתים תאי. עם זאת, זה עדיין נשאר קשה לעקוב IL-22 ביטוי באתרם, או במצב הרגיל או מצבים דלקתיים. פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשה לפתח מודל עכבר כתב IL-22, אשר מאפשר לנו למקם את התאים לבטא כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
