Summary

Visualisierung von IL-22-exprimierenden Lymphozyten unter Verwendung Reporter Mäuse

Published: January 25, 2017
doi:

Summary

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Abstract

Reporter-Mäuse wurden weithin verwendet, um die Lokalisierung der Expression von Genen gezielt zu beobachten. Dieses Protokoll konzentriert sich auf eine Strategie einen neuen transgenen Reporter Mausmodell zu etablieren. Wir entschieden uns für Interleukin (IL) 22 Genexpression zu visualisieren, da dieses Zytokin wichtige Aktivitäten im Darm hat, wo sie einen Beitrag durch eine Entzündung beschädigte Gewebe zu reparieren. Reporter – Systeme bieten erhebliche Vorteile gegenüber anderen Methoden der Produkte in vivo zu identifizieren. Im Falle von IL-22, hatte andere Studien ersten Zellen aus Geweben isoliert und dann die Zellen in vitro erneut stimuliert. IL-22, das normalerweise ausgeschieden wird, wurde in den Zellen unter Verwendung eines Arzneimittels gefangen, und die intrazelluläre Färbung wurde verwendet, um es zu visualisieren. Dieses Verfahren identifiziert Zellen, die Herstellung von IL-22, aber nicht bestimmen , ob sie in vivo Dabei wurden. Der Reporter Design enthält ein Gen für ein fluoreszierendes Protein (tdTomato) in den IL-22-Gen in einer solchen wa Einfügeny , die das fluoreszierende Protein nicht sezerniert werden und bleibt daher in den produzierenden Zellen in vivo gefangen. Fluoreszierende Produzenten können dann in Gewebeschnitten oder durch ex vivo Analyse durch Durchflusszytometrie visualisiert werden. Die eigentlichen Bauprozess für die Reporter enthalten ein bakterielles künstliches Chromosom Recombineering, die die IL-22-Gen enthielt. Dieses erzeugte Chromosom wurde dann in das Mausgenom eingeführt. Homöostatischen IL-22-Reporter-Expression in verschiedenen Mausgeweben, einschließlich der Milz, Thymus, Lymphknoten, Peyerschen Plaques und Darm, durch Durchflusszytometrie-Analyse beobachtet. Kolitis wurde von T-Zellen (CD4 + CD45RBhigh) Transfer induziert und Reporterexpression sichtbar gemacht wurde. Positive T-Zellen wurden zunächst die in den mesenterischen Lymphknoten und dann akkumuliert sie in der Lamina propria des distalen Dünndarm und Dickdarm Gewebe. Die Strategie BACs gab gute Treue Reporterexpression im Vergleich zu IL-22 Expres mitsion, und es ist einfacher als Knock-in-Verfahren.

Introduction

Zelltyp-spezifische Expression von Reportergenen ist nützlich exprimierenden Zellen in das Zielgewebe unter homöostatischen und gestörter Zustände aktiv zu identifizieren. Es ermöglicht auch die Reinigung dieser Zellen, die lebensfähig bleiben, ihre anderen Eigenschaften zu untersuchen. Reporter-Mäuse wurden bei der Aufklärung der Wirkmechanismus für bestimmte Zytokine, Transkriptionsfaktoren und regulatorische Elemente verwendet. Bisherigen Strategien 1, 2, 3 haben sich auf Klopfen der Reporter in den Ziel – Locus in der Maus – Chromosom, ein zeitraubende und kostspieliges Verfahren weitgehend verlassen. Somit ist eine einfachere Methode zur Erzeugung von Reportermäusen wünschenswert.

Cytokine sind eine breite Klasse von kleinen, sekretierte Proteine ​​/ Peptide, die Immunreaktionen durch interzelluläre Signalübertragung regulieren. Interleukin 22 (IL-22) ist ein Zytokin mit vielen Aktivitäten berichtet, einschließlich Barriere function, die Reparatur von Gewebe und Entzündungen 4. Obwohl IL-22 anfangs als T-Zellprodukt 5 demonstrierte nachfolgende entdeckt wurde berichtet seine Expression in natürlichen Killer (NK) -Zellen in Menschen und Mäusen 6 7 und in anderen Klassen von angeborenen Lymphozyten 8. Trotz intensiver Beobachtung von IL-22-produzierenden Zellen, die Visualisierung von IL-22 bisher erforderlichen ex vivo Stimulation und Permeabilisierung zu Flecken mit Antikörpern. Daher wäre Roman IL-22-Reporter-Mäuse ein sehr nützliches Werkzeug, um die Funktion von IL-22 in Homöostase und pathogenen Prozessen zu untersuchen.

Hier entwickelten wir ein vereinfachtes transgenes Mausmodell reporter die IL-22-produzierenden Zellen in vivo und in vitro zu beobachten. Mit Hilfe eines BAC Recombineering Methode 9, legten wir die tdTomato cDNA – Sequenz mit Poly – A – Signal – Fragmente in die IL-22 locuns und ersetzt Exon 1. Die anderen untranslatierten Regionen, Exons und regulatorische Elemente nicht gestört wurden, da wir die natürliche Regulation von IL-22, so viel wie möglich zu imitieren möchten. Der Ort der Reporter Insertion unterbricht die Signalsequenz, was zu der Ansammlung des Reporter innerhalb der produzierenden Zellen, im Gegensatz zu IL-22 selbst, die schnell ausgeschieden wird. Dieses neue Verfahren kann auch zur Erzeugung von Reportermäusen für andere sekretierte Proteine ​​angewendet werden.

Protocol

Alle Tiere erhielten die richtige Pflege in Übereinstimmung mit den im Guide 2011 skizzierten experimentellen Verfahren zur Pflege und Verwendung von Labortieren Komitee Frederick National Laboratory for Cancer Research. 1. Erzeugung von IL-22-tdTomato Reporter Mäusen durch BAC Recombineering HINWEIS: Die Mäuse sollten bewusstlos sein und nicht als Reaktion auf einen schädlichen Reiz bewegen. Sterilisieren Sie den OP-Bereich mit 70% Ethanol und zu sterilisieren…

Representative Results

Ein Maus – IL-22 Reporter – Transgen wurde unter Verwendung von Recombineering erstellt eine bakterielle künstliche Chromosom tragen die IL-22 – Locus zu ändern. Figur 1 zeigt ein Diagramm von pBACe3.6 Vektor , der das Gen sacBII, einen positiven Selektionsmarker enthält, und Chloramphenicol – Antibiotikum – Resistenzgen 11. Nach der Einführung tdTomato in Exon 1 wurde die Signalpeptidsequenz unterbrochen wird , wie in Abbildu…

Discussion

IL-22 spielt eine wesentliche Rolle bei der angeborenen Immunabwehr und Gewebeumbau. IL-22-produzierenden Zellen wurden ex vivo durch intrazelluläre Anfärbung identifiziert. Allerdings bleibt es immer noch schwierig , IL-22 – Expression in situ zu verfolgen, entweder im normalen Zustand oder in entzündlichen Erkrankungen. Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren ein IL-22 – Reporter Mausmodell, das uns die Reporter-exprimierenden Zellen in vivo zu lokalisieren ermöglicht zu entwicke…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

Materials

RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

References

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Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

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