Визуализация IL-22-экспрессирующих Лимфоциты Использование Reporter Мыши
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
Reporter мыши широко используются для наблюдения локализации экспрессии целевых генов. Этот протокол фокусируется на стратегии по созданию новой модели мыши трансгенный репортер. Мы выбрали для визуализации экспрессии гена интерлейкина (IL) 22, потому что этот цитокин имеет важные действия в кишечнике, где она способствует ремонт тканей, поврежденных воспалением. Reporter системы предлагают значительные преимущества по сравнению с другими методами идентификации продуктов в естественных условиях. В случае IL-22, другие исследования были впервые выделили клетки из тканей , а затем повторно стимулировали клетки в пробирке. IL-22, который обычно секретируется, был в ловушке внутри клеток с помощью препарата, и внутриклеточное окрашивание использовали для визуализации его. Этот метод идентифицирует клетки , способные продуцировать IL-22, но он не определяет , были ли они делают это в естественных условиях. Конструкция репортер включает вставку гена флуоресцентного белка (tdTomato) в ген IL-22 в таком промY , что флуоресцентный белок не может быть секретируется и , следовательно , остается в ловушке внутри клеток , продуцирующих в естественных условиях. Флуоресцентные производители могут быть визуализированы в срезах тканей или экс естественных условиях анализа с помощью проточной цитометрии. Сам процесс строительства для репортера включали recombineering бактериальную искусственную хромосому, которая содержала ген IL-22. Эта хромосома инженерии была затем введена в геном мыши. Гомеостатическое выражение репортер IL-22 наблюдалось в различных тканях мышей, в том числе селезенки, вилочковой железы, лимфатических узлов, патч бляшках, и кишечника, с помощью проточной цитометрии. Колит индуцируют Т-клеток (CD4 + CD45RBhigh) передачи, и выражение репортер визуализировали. Позитивные Т-клетки сначала присутствуют в брыжеечные лимфатические узлы, а затем они накапливаются в собственной пластинке слизистой оболочки дистального тонкой кишки и толстой кишки тканей. Стратегия, использующая BACs дал выражение репортер хорошо точность воспроизведения по сравнению с IL-22 ExpresSion, и это проще, чем нокаута в процедурах.
Introduction
Ячейка типа специфическая экспрессия репортерных генов полезно для идентификации клеток, активно выражающих цель в тканях под гомеостаза и возмущенных состояний. Она также позволяет для очистки этих клеток, которые остаются жизнеспособными, чтобы изучить их другие свойства. Репортер мышей были использованы в выяснении механизма действия для специфических цитокинов, факторов транскрипции и регуляторных элементов. Предыдущие стратегии 1, 2, 3 в основном полагались на стука репортера в локуса – мишени в хромосоме мыши, процедура отнимает много времени и дорого. Таким образом, более простой способ для генерации репортерных мышей желательно.
Цитокины представляют собой широкий класс небольших секретируемых белков / пептидов, которые регулируют иммунный ответ через межклеточное сигнализации. Интерлейкина 22 (IL-22) представляет собой цитокин со многими сообщили о деятельности, в том числе барьер фуnction, восстановление тканей и воспаление 4. Хотя IL-22 первоначально был обнаружен как Т-клеточного продукта 5, последующие доклады продемонстрировали свое выражение в естественных киллеров (NK) клеток в организме человека 6 и 7 мышей и в других классах врожденными лимфоцитов 8. Несмотря на обширные наблюдения IL-22-продуцирующие клетки, визуализации IL-22 , ранее необходимой стимуляции ех естественных условиях и проницаемости к образованию пятен с антителами. Таким образом, роман IL-22 мышей репортер был бы очень полезным инструментом для исследования функции IL-22 в гомеостатических и болезнетворных процессов.
Здесь мы разработали упрощенную модель трансгенной мыши репортер наблюдать за IL-22-продуцирующие клетки в естественных условиях и в пробирке. Используя метод BAC recombineering 9, мы вставили последовательность кДНК tdTomato с поли фрагменты сигнала в IL-22 LOCнас и заменили экзона 1. Другие нетранслируемые области, экзоны и регуляторные элементы не были возмущенной, так как мы хотели бы, чтобы имитировать естественную регуляцию IL-22 в максимально возможной степени. Сайт вставки репортер приводит к нарушению сигнальной последовательности, что приводит к накоплению репортера внутри клеток, продуцирующих, в отличие от IL-22 сам по себе, который быстро секретируется. Этот новый способ может быть также применен к порождению репортерных мышей для других секретируемых белков.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22 играет существенную роль в защите хозяина врожденной и ткани ремоделирования. IL-22-продуцирующие клетки были идентифицированы исключая виво с помощью внутриклеточного окрашивания. Тем не менее, она по- прежнему остается трудно отслеживать экспрессию IL-22 на месте, в нормал?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
- Awasthi, A., et al. Cutting edge: IL-23 receptor gfp reporter mice reveal distinct populations of IL-17-producing cells. J Immunol. 182, 5904-5908 (2009).
- Price, A. E., Reinhardt, R. L., Liang, H. E., Locksley, R. M. Marking and quantifying IL-17A-producing cells in vivo. PLoS One. 7, e39750 (2012).
- Kamanaka, M., et al. Expression of interleukin-10 in intestinal lymphocytes detected by an interleukin-10 reporter knockin tiger mouse. Immunity. 25, 941-952 (2006).
- Sonnenberg, G. F., Fouser, L. A., Artis, D. Border patrol: regulation of immunity, inflammation and tissue homeostasis at barrier surfaces by IL-22. Nat Immunol. 12, 383-390 (2011).
- Dumoutier, L., Louahed, J., Renauld, J. C. Cloning and characterization of IL-10-related T cell-derived inducible factor (IL-TIF), a novel cytokine structurally related to IL-10 and inducible by IL-9. J Immunol. 164, 1814-1819 (2000).
- Cella, M., et al. A human natural killer cell subset provides an innate source of IL-22 for mucosal immunity. Nature. 457, 722-725 (2009).
- Sanos, S. L., et al. RORgammat and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat Immunol. 10, 83-91 (2009).
- Spits, H., et al. Innate lymphoid cells–a proposal for uniform nomenclature. Nat Rev Immunol. 13, 145-149 (2013).
- Mazzucchelli, R. I., et al. Visualization and identification of IL-7 producing cells in reporter mice. PLoS One. 4, e7637 (2009).
- Shen, W., Hixon, J. A., McLean, M. H., Li, W. Q., Durum, S. K. IL-22-Expressing Murine Lymphocytes Display Plasticity and Pathogenicity in Reporter Mice. Front Immunol. 6, 662 (2015).
- Gong, S., Yang, X. W., Li, C., Heintz, N. Highly efficient modification of bacterial artificial chromosomes (BACs) using novel shuttle vectors containing the R6Kgamma origin of replication. Genome Res. 12, 1992-1998 (2002).
- Shen, W., Huang, Y., Tang, Y., Liu, D. P., Liang, C. C. A general method to modify BACs to generate large recombinant DNA fragments. Mol Biotechnol. 31, 181-186 (2005).
- Cho, A., Haruyama, N., Kulkarni, A. B. Generation of transgenic mice. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. Chapter 19, Unit 19 11 (2009).
- Danneman, P. J., Stein, S., Walshaw, S. O. Humane and practical implications of using carbon dioxide mixed with oxygen for anesthesia or euthanasia of rats. Lab Anim Sci. 47, 376-385 (1997).
- Omata, Y., et al. Isolation of coccidian enteroepithelial stages of Toxoplasma gondii from the intestinal mucosa of cats by Percoll density-gradient centrifugation. Parasitol Res. 83, 574-577 (1997).
- Kumar, N., Borth, N. Flow-cytometry and cell sorting: an efficient approach to investigate productivity and cell physiology in mammalian cell factories. Methods. 56, 366-374 (2012).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Cryosectioning tissues. CSH Protoc. 2008, pdb.prot4991 (2008).
- Hilbe, W., et al. Comparison of automated cellular imaging system and manual microscopy for immunohistochemically stained cryostat sections of lung cancer specimens applying p53, ki-67 and p120. Oncol Rep. 10, 15-20 (2003).
- Suzuki, Y., Furukawa, M., Abe, J., Kashiwagi, M., Hirose, S. Localization of porcine trappin-2 (SKALP/elafin) in trachea and large intestine by in situ hybridization and immunohistochemistry. Histochem Cell Biol. 114, 15-20 (2000).
- Wolk, K., et al. IL-22 increases the innate immunity of tissues. Immunity. 21, 241-254 (2004).
- Brand, S., et al. IL-22 is increased in active Crohn’s disease and promotes proinflammatory gene expression and intestinal epithelial cell migration. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 290, G827-G838 (2006).
- Nagalakshmi, M. L., Rascle, A., Zurawski, S., Menon, S., Waal Malefyt, d. e., R, Interleukin-22 activates STAT3 and induces IL-10 by colon epithelial cells. Int Immunopharmacol. 4, 679-691 (2004).
- Maloy, K. J., Powrie, F. Intestinal homeostasis and its breakdown in inflammatory bowel disease. Nature. 474, 298-306 (2011).
- Andoh, A., et al. Interleukin-22, a member of the IL-10 subfamily, induces inflammatory responses in colonic subepithelial myofibroblasts. Gastroenterology. 129, 969-984 (2005).
- Bhan, A. K., Mizoguchi, E., Smith, R. N., Mizoguchi, A. Colitis in transgenic and knockout animals as models of human inflammatory bowel disease. Immunol Rev. 169, 195-207 (1999).
- Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75, 274-282 (1993).
- Powrie, F. Immune regulation in the intestine: a balancing act between effector and regulatory T cell responses. Ann N Y Acad Sci. 1029, 132-141 (2004).
- Ahlfors, H., et al. IL-22 fate reporter reveals origin and control of IL-22 production in homeostasis and infection. J Immunol. 193, 4602-4613 (2014).
