기자 마우스를 사용하여 IL-22 발현 림프구의 시각화
Summary
We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.
Abstract
리포터 생쥐 널리 표적 유전자의 발현을 관찰 지역화 사용되고있다. 이 프로토콜은 새로운 유전자 변형 기자 마우스 모델을 수립하기위한 전략에 초점을 맞추고 있습니다. 우리는이 사이토 카인은 염증 조직 손상을 복구에 기여하는 부위에 중요 활동을 갖기 때문에, 인터루킨 (IL) (22)의 유전자 발현을 가시화하도록 선택. 리포터 시스템은 생체 내에서 제품을 식별하는 다른 방법에 비해 상당한 이점을 제공한다. IL-22의 경우, 다른 연구는 먼저 조직으로부터 세포를 격리 한 후, 시험관 내에서 세포를 재 자극. IL-22, 정상적으로 분비, 약물을 사용하여 균체 내에 포집하고, 세포 염색하여 시각화 하였다. 이 방법은 IL-22을 제조 할 셀을 식별하는, 그러나 생체 내에서 그렇게 한 여부를 결정하지 않는다. 리포터 설계는 이러한 WA에서 IL-22 유전자에 형광 단백질 (tdTomato)에 대한 유전자를 삽입 포함형광 단백질 따라서 분비 할 수없는 예는 생체 내에서 생산 세포 안에 갇혀 남아. 형광 제작자는 조직 절편 또는 유동 세포 계측법을 통하여 생체 외 분석에 의해 시각화 될 수있다. 리포터의 실제 구성 프로세스는 IL-22 유전자를 함유 된 세균 인공 염색체를 포함 recombineering. 이 조작 된 후 염색체 마우스 게놈에 도입 하였다. 항상성 IL-22 발현은 리포터 분석을 유동 세포 계측법에 의한 비장, 흉선, 림프절, 파이어 판 및 소장을 포함하여 다른 마우스 조직에서 관찰되었다. 대장염은 T 세포 (CD4 + CD45RBhigh) 전송에 의해 유도하고, 기자의 발현을 시각화했다. 양성 T 세포 장간막 림프절 제 존재하고 그들 선단부 소장과 결장 조직의 고유 층 내부에 축적. BAC에를 사용하는 전략은 IL-22 EXPRES에 비해 좋은 충실도 기자의 표현을 주었다시온, 그리고 노크 절차보다 간단하다.
Introduction
리포터 유전자의 세포 유형 특정 표현은 적극적으로 항상성과 교란 된 상태에서 조직의 목표를 발현하는 세포를 식별하는 데 유용합니다. 그것은 또한 다른 특성을 연구하기 위해, 생존을 유지 이러한 세포의 정제 할 수 있습니다. 리포터 생쥐 특정 사이토 카인, 전사 인자와 조절 요소에 대한 작용 기전을 밝히는데 이용 하였다. 이전 전략 1, 2, 3은 주로 마우스 염색체 시간 소모적이고 비용이 많이 드는 절차 표적 유전자좌에 리포터 노킹에 의존해왔다. 그러므로, 리포터 생쥐의 발생을위한 간단한 방법이 바람직하다.
사이토 카인은 세포 간 신호 전달을 통해 면역 반응을 조절하는 작은 분비 단백질 / 펩티드의 다양한 클래스입니다. 인터루킨 22 (IL-22)는 많은과 사이토 카인 장벽 쿵푸 등의 활동을보고있다nction, 조직 복구 및 염증 4. IL-22은 T 초기 셀 제품 5로 발견되었지만, 후속 리포트 인간 6 마우스 (7)과 선천성 림프구 (8)의 다른 클래스에서 자연 살해 (NK) 세포에서의 발현을 입증 하였다. 항체와 얼룩에 IL-22 이전에 필요한 생체 자극과 permeabilization의 광범위한 IL-22 생산 세포의 관찰, 시각화에도 불구하고. 따라서, 신규 한 IL-22 리포터 생쥐 항상성 병원성 과정에서 IL-22의 기능을 연구하기위한 유용한 도구가 될 것이다.
여기서는 생체 내 및 시험 관내에서 IL-22 생산 세포를 관찰 할 간략한 리포터 트랜스 제닉 마우스 모델을 개발 하였다. 혈중 알코올 농도를 recombineering 방법 9를 사용하여, 우리는 IL-22에 폴리 LOC의 신호 단편을 tdTomato cDNA 서열을 삽입우리와 우리는 가능한 한 IL-22의 자연 조절을 모방하고자하기 때문에 다른 번역되지 않은 지역, 엑손, 규제 요소, 교란되지 않은 엑손 1을 대체했다. 리포터 삽입 부위는 IL-22 그 자체 빠르게 분비 달리 생산 세포 내부 리포터의 축적의 결과로, 신호 서열을 방해. 이 새로운 방법은 다른 분비 단백질 리포터 생쥐의 발생에도 적용 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
IL-22는 타고난 호스트 방어 및 조직 리모델링에 필수적인 역할을한다. IL-22 생산 세포는 세포 내 염색 생체 확인되었다. 그러나, 여전히 정상 상태 또는 염증성 질환의 하나, 반응계에서 IL-22의 발현을 추적하는 것이 곤란 남아있다. 이 프로토콜은 생체 내에서 리포터 발현 세포 지역화 우리 가능하게하는 IL-22 리포터 마우스 모델을 개발하기위한 새로운 방법을 설명한다. 리포?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).
Materials
| RP23-401E11 BAC | Thermo Fisher Scientific | RPCI23.C | Need gene ID: 50929 |
| NucleoBond BAC 100 | Takara Clontech | 740579 | |
| PCR SuperMix High Fidelity | Thermo Fisher Scientific | 10790020 | |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | |
| SpeI | New England Biolabs | R0133S | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 10855-001 | 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride |
| Anti-mouse CD3 | eBioscience | 11-0031 | |
| Anti-mouse CD4 | eBioscience | 17-0041 | |
| Anti-mouse CD45 | Thermo Fisher Scientific | MCD4530 | |
| Anti-mouse CD45RB | eBioscience | 11-0455 | |
| Anti-mouse RFP | Abcam | Ab62341 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14175145 | KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose |
| Dnase I | Roche | 10104159001 | |
| ACK lysing buffer | Thermo Fisher Scientific | A1049201 | |
| Percoll | GE healthcare life sciences | 17-0891-01 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| Dispase II (neutral protease, grade II) | Roche | 4942078001 | |
| IX70 inverted fluorescence microscope | Olympus | Ask for quote | |
| Nikon Eclipse 80i microscope | Nikon | Ask for quote | |
| Dynal shaker | Electron Microscopy Science | 61050-10 | |
| FACSAria | BD Bioscience | Ask for quote | |
| LSRII SORP/flow cytometry | Becton, Dickinson and Company | Ask for quote |
References
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