Summary

Visualisation de l'IL-22 exprimant Lymphocytes en utilisant des souris Reporter

Published: January 25, 2017
doi:

Summary

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Abstract

Des souris rapporteurs ont été largement utilisés pour observer la localisation de l'expression des gènes ciblés. Ce protocole met l'accent sur une stratégie visant à établir un nouveau modèle de souris transgénique journaliste. Nous avons choisi de visualiser l'interleukine (IL) 22 l'expression des gènes, car cette cytokine a des activités importantes dans l'intestin, où elle contribue à réparer les tissus endommagés par l'inflammation. Les systèmes rapporteurs offrent des avantages considérables par rapport aux autres procédés permettant d'identifier les produits in vivo. Dans le cas de l' IL-22, d' autres études ont d' abord isolé les cellules des tissus, puis re-stimulé les cellules in vitro. IL-22, qui est normalement sécrétée, est emprisonné à l'intérieur des cellules à l'aide d'un médicament, et une coloration intracellulaire a été utilisé pour visualiser. Cette méthode identifie les cellules capables de produire de l' IL-22, mais il ne détermine pas si elles le faisaient in vivo. La conception reporteur comprend l'insertion d'un gène pour une protéine fluorescente (tdTomato) dans le gène IL-22 dans un tel way que la protéine fluorescente ne peut être sécrété et donc reste piégée à l' intérieur des cellules productrices in vivo. Producteurs fluorescentes peuvent ensuite être visualisées dans des coupes de tissus ou par une analyse ex vivo par cytométrie de flux. Le processus de construction proprement dite pour le journaliste inclus recombineering un chromosome artificiel bactérien qui contenait le gène IL-22. Ce chromosome manipulé est ensuite introduit dans le génome de la souris. Homéostatique de l'IL-22 reporteur expression a été observée dans les tissus de souris différentes, y compris la rate, le thymus, les ganglions lymphatiques, les plaques de Peyer, et de l'intestin, par cytométrie de flux. Colite a été induite par des cellules T (CD4 + CD45RBhigh) le transfert et l' expression du journaliste a été visualisé. Les cellules T positives sont d'abord présentes dans les ganglions lymphatiques mésentériques, puis ils se sont accumulés à l'intérieur de la lamina propria des petits tissus de l'intestin grêle et du côlon distal. La stratégie utilisant BACs a donné une bonne fidélité reporter l'expression par rapport à l'IL-22 expression, et il est plus simple que les procédures knock-in.

Introduction

Cellule expression spécifique du type de gènes rapporteurs est utile pour identifier les cellules exprimant activement la cible dans les tissus sous état homéostatique et perturbés. Elle permet aussi la purification de ces cellules, qui restent viables, pour étudier leurs autres propriétés. Des souris rapporteurs ont été utilisés dans l'élucidation du mécanisme d'action de cytokines spécifiques, des facteurs de transcription, et des éléments régulateurs. Stratégies Précédent 1, 2, 3 ont largement compté sur frapper le journaliste dans le locus cible dans le chromosome de la souris, une procédure fastidieuse et coûteuse. Ainsi, un procédé plus simple pour la génération de souris rapporteurs est souhaitable.

Les cytokines sont une large classe de petites protéines sécrétées / peptides qui régulent les réponses immunitaires par le biais de la signalisation intercellulaire. Interleukine 22 (IL-22) est une cytokine avec beaucoup rapporté activités, y compris la barrière function, la réparation des tissus, et l' inflammation 4. Bien que l' IL-22 a d' abord été découvert en tant que produit des cellules T 5, les rapports subséquents ont démontré son expression dans tueuses naturelles (cellules NK) chez les humains et les souris 6 7 et dans d' autres classes de lymphocytes innées 8. Malgré une vaste observation de cellules-22 produisant IL, la visualisation de l' IL-22 précédemment nécessaire stimulation ex vivo et perméabilisation aux taches avec des anticorps. Par conséquent, le roman IL-22 souris rapporteurs serait un outil très utile pour étudier la fonction de l'IL-22 dans les processus homéostatique et pathogènes.

Ici, nous avons développé un modèle de souris transgénique journaliste simplifiée pour observer les cellules IL-22 produisant in vivo et in vitro. En utilisant une méthode BAC recombineering 9, nous avons inséré la séquence tdTomato ADNc avec Poly A fragments de signal dans l'IL-22 locnous et remplacé exon 1. Les autres régions, exons, et des éléments régulateurs non traduites ne sont pas perturbés, puisque nous voudrions imiter la régulation naturelle de l'IL-22, autant que possible. Le site d'insertion reporteur perturbe la séquence signal, ce qui entraîne l'accumulation du reporteur dans les cellules productrices, contrairement à l'IL-22 elle-même, qui est rapidement sécrété. Ce nouveau procédé peut également être appliqué à la production de souris rapporteurs pour d'autres protéines sécrétées.

Protocol

Tous les animaux ont reçu des soins appropriés conformément aux procédures expérimentales décrites dans le Guide 2011 pour les soins et l'utilisation des animaux de laboratoire Comité de Frédéric Laboratoire national de recherche sur le cancer. 1. Production d'IL-22-tdTomato Reporter Souris par BAC Recombineering NOTE: Les souris doivent être inconscient et ne se déplacent pas en réponse à un stimulus nociceptif. Stériliser la zone chirurgical…

Representative Results

A murine IL-22 journaliste transgène a été créée en utilisant recombineering pour modifier un chromosome bactérien artificiel portant le locus IL-22. La figure 1 représente un schéma du vecteur contenant le gène de pBACe3.6 sacBII, un marqueur de sélection positif et chloramphénicol gène de résistance à 11. Après l' introduction tdTomato dans l' exon 1, la séquence du peptide signal a été perturbé, comme représ…

Discussion

IL-22 joue un rôle essentiel dans la défense de l'hôte et le remodelage des tissus innées. Des cellules de production d' IL-22 ont été identifiées par une coloration ex vivo intracellulaire. Cependant, il reste encore difficile de suivre l' expression de l' IL-22 in situ, soit dans l'état normal ou dans des conditions inflammatoires. Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour développer un modèle de souris reporter IL-22, ce qui nous permet de localiser les cellules r…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Kelli Czarra and Megan Karwan for animal technical assistance, Kathleen Noer and Roberta Matthai for flow cytometry assistance, and Donna Butcher andMiriam R. Anver for pathology analysis. This project was supported by a grant from the Ely and Edythe Broad Foundation (to Scott Durum) and has been funded in whole or in part with federal funds from the National Cancer Institute, National Institutes of Health, under Contract No. HHSN261200800001E (MRA).

Materials

RP23-401E11 BAC Thermo Fisher Scientific RPCI23.C Need gene ID: 50929
NucleoBond BAC 100 Takara Clontech 740579
PCR SuperMix High Fidelity Thermo Fisher Scientific 10790020
PI-SceI New England Biolabs R0696S
SpeI New England Biolabs R0133S
LB Broth Thermo Fisher Scientific 10855-001 1L: 10 g SELECT Peptone 140, 5 g SELECT Yeast Extract, 5 g sodium chloride 
Anti-mouse CD3 eBioscience 11-0031
Anti-mouse CD4 eBioscience 17-0041
Anti-mouse CD45 Thermo Fisher Scientific MCD4530
Anti-mouse CD45RB eBioscience 11-0455
Anti-mouse RFP Abcam Ab62341
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Thermo Fisher Scientific 14175145 KCl, KH2PO4, Na2HPO4, NaHCO3, NaCl, D-Glucose
Dnase I Roche 10104159001
ACK lysing buffer Thermo Fisher Scientific A1049201
Percoll GE healthcare life sciences 17-0891-01
Collagenase D Roche 11088858001
Dispase II (neutral protease, grade II) Roche 4942078001
IX70 inverted fluorescence microscope Olympus Ask for quote
Nikon Eclipse 80i microscope Nikon Ask for quote
Dynal shaker Electron Microscopy Science 61050-10
FACSAria BD Bioscience Ask for quote
LSRII SORP/flow cytometry Becton, Dickinson and Company  Ask for quote

References

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Shen, W., Li, W., Hixon, J. A., Andrews, C., Durum, S. K. Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice. J. Vis. Exp. (119), e54710, doi:10.3791/54710 (2017).

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