Оценка сетчатке микроглии фагоцитарной функции<em> В Vivo</em> С использованием анализа проточной цитометрии на основе
Summary
Микроглии фагоцитоза имеет решающее значение для поддержания гомеостаза тканей и недостаточной фагоцитарной функции были замешаны в патологии. Тем не менее, оценки функции микроглии в естественных условиях является технически сложной задачей. Мы разработали простой, но надежный метод для точного мониторинга и количественной оценки фагоцитарной потенциала микроглии в физиологической обстановке.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
Общая цель этого метода заключается в точной оценки и количественного определения в естественных условиях микроглии фагоцитоза. Микроглии являются резидентные макрофаги ткани центральной нервной системы (ЦНС). Они выполняют различные функции, чтобы обеспечить поддержание гомеостаза тканей. К ним относятся иммунного надзора, секрецию нейротрофических факторов и, ключевое значение, фагоцитоз 1. Микроглии фагоцитоза играет ключевую роль в нескольких важных событий во время развития головного мозга и сетчатки глаза, такие как фагоцитоз несущественных синапсов (синаптических подрезке) и удаление апоптотических нейронов 2-4. Кроме того, микроглии фагоцитоз поврежденных или апоптотических нейронов, клеточных остатков и нарушало микробов было показано, что необходимо для поддержания гомеостаза ЦНС до зрелого возраста 5. Наконец, микроглии фагоцитоза участвует в патогенезе нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и связанных с возрастомдегенерация желтого пятна, где было высказано предположение , что неисправны или недостаточная пропускная способность фагоцитарной может способствовать накоплению амилоида-бета (A & beta ; ) бляшек и друз, соответственно 6,7.
Микроглии функция жестко регулируется их микросреды, в частности растворимых факторов, таких как фактор роста опухоли-бета или межклеточных взаимодействий. Нейроны конститутивно экспрессируют несколько клеточной поверхности лиганды, такие как CD200 и CX3CL1, в то время как микроглии исключительно выражают соответствующие рецепторы CD200R и CX3CR1. Эти рецепторы содержат иммунорецептора ингибирования на основе тирозина мотивы (ITIMs) в их внутриклеточной части. Эти рецепторы ингибитора имеют решающее значение для предотвращения чрезмерной стимуляции микроглии, которая может способствовать нейровоспаления. Таким образом, при нормальных физиологических условиях, межклеточные взаимодействия между нейронами и микроглии держать микроглии в состоянии покоя. Во время повреждения ткани, однако, нейроны могут понижающей регуляции ехрression этих лигандов, удаление их ингибирующее действие на активацию микроглии. Микроглии функции ( в том числе фагоцитоза), таким образом , тесно связана с их микросреды 8. Тем не менее, на сегодняшний день не существует стандартизированные тесты для изучения микроглии фагоцитоза в физиологическом контексте, или таким образом, чтобы полностью повторяющей их микросреду ЦНС.
Несколько анализы были разработаны для измерения фагоцитарную активность микроглии в пробирке, где первичные микроглии или линии микроглии клеточные культивировали с клетками – мишенями (например, апоптотических нейронов) или флуоресцентно меченных бусинок. Целевое поглощение затем оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии изображений или проточной цитометрии 9-12. Эти анализы позволяют тестирование как фармакологические или генетические манипуляции могут повлиять на микроглии фагоцитоза и, в то время как информативный, не в полной мере повторить комплекс в естественных условиях окружающей среды. Косвенные методы изучения микроглии фагоцитозав естественных условиях сообщалось: они выполняются с помощью окрашивания молекул как полагают, участвуют в фагоцитозе (например, CD68), оценка физической близости микроглии и мишеней для фагоцитоза (например, скомпрометированных нейронов или синапсов элементов), или с помощью иммуногистохимического обнаружения фагоцитирующих целевые задачи в клетках микроглии (например, A & beta ; ) 13-17 лет. Два исследования использовали более прямые подходы к оценке микроглии фагоцитоза в естественных условиях. Хьюз и его коллеги использовали методы визуализации для измерения микроглии поглощение гранул доставленных через внутричерепного маршруту 18. Sierra и др. Разработали точный метод для количественной оценки микроглии фагоцитоз апоптотических клеток с использованием сложных методов визуализации 4. Тем не менее, эти методы включают сложные протоколы для подготовки ткани, секционирование, визуализации и анализа данных. Ранее мы использовали анализ проточной цитометрии для оценки фагоцитоза фоторецептора изэр сегменты по пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) клеток в культуре 19. Здесь мы опишем протокол для быстрой оценки поглощения флуоресцентно меченных частиц микроглии сетчатки глаза в качестве количественной меры в естественных условиях микроглии фагоцитоза.
Протокол мы описываем здесь обеспечивает надежное и количественное измерение сетчатки микроглии фагоцитоза в чуть менее шести часов в трех важных этапов: (1) поставки интравитреального флуоресцентно меченый частиц, (2) сбора и подготовки ткани сетчатки, и (3) потока цитометрии анализ. Метод, который мы разработали это надежный метод для оценки микроглии фагоцитоза в сетчатке, и она может быть успешно использован для тестирования, как различные соединения или генетические манипуляции изменяют этот ключ микроглиальную функцию в физиологических условиях. В специализированной области ЦНС, сетчатка легко доступной модели системы для изучения функции микроглии 20. В то время как этот метод был разработан в Tон глаз, мы считаем, что это может быть полезно для всех неврологов, расследующих функции микроглии фагоцитарную.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существуют три важных шагов в этом способе: (1) инъекции в стекловидное флуоресцентно меченый частиц; (2) сбор и подготовка ткани сетчатки; и (3) Цитометрический анализ. Мы рекомендуем, чтобы исследователи практике Интравитреальная инъекции перед выполнением метода мы представляем здесь….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
