網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em>インビボ</em>フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました
Summary
組織の恒常性と不十分な食細胞機能の維持が病態に関与しているためにミクログリアの貪食作用が重要です。しかしながら、 インビボでのミクログリアの機能を評価することは技術的に困難です。私たちは、正確に監視し、生理的な環境の中でミクログリアの貪食の可能性を定量化するためのシンプルでありながら堅牢な技術を開発しました。
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
この方法の全体的な目標を正確に評価し、 生体内ミクログリア食作用に定量化することです。ミクログリアは、中枢神経系（CNS）の組織常在性マクロファージです。彼らは、組織恒常性の維持を確実にするために様々な機能を実行します。これらは、免疫監視機構、神経栄養因子の分泌と、極めて重要で、貪食1が含まれます。ミクログリアの貪食は、無関係なシナプス（シナプス剪定）の食作用およびアポトーシスニューロン2-4の除去などの脳や網膜の開発中に、いくつかの重要なイベント、内のキーです。また、損傷を受けたまたはアポトーシスニューロンのミクログリア食作用、細胞の破片、および侵入微生物が成人期5を介して中枢神経系の恒常性を維持するために必須であることが示されています。最後に、ミクログリア食作用は、アルツハイマー病、年齢関連を含むいくつかの神経変性疾患の病因に関与しています不良または不十分な貪食能は、アミロイドβ（Aβ）斑とドルーゼン、それぞれ6,7のビルドアップに寄与し得ることが示唆されている黄斑変性症、。
ミクログリア機能はしっかり特に、腫瘍増殖因子β、または細胞 – 細胞相互作用などの可溶性因子によって、それらの微小環境によって調節されます。ミクログリアは、排他的にそれぞれの受容体CD200RとCX3CR1を表現しながら、ニューロンは恒常的に、このようなCD200およびCX3CL1などのいくつかの細胞表面リガンドを発現します。これらの受容体は、それらの細胞内部分に、免疫レセプターチロシンベース阻害モチーフ（のITIM）を含有します。これらの受容体は、神経炎症に寄与することができる、ミクログリアの過剰刺激を防止するために重要である阻害剤。したがって、通常の生理学的条件下で、ニューロンとミクログリアの間の細胞間相互作用は、休止状態にミクログリアを保ちます。組織損傷の間、ただし、ニューロンは、EXPをダウンレギュレートすることができこれらのリガンドのression、ミクログリアの活性化に対する阻害効果を除去します。 （食作用を含む）ミクログリアの機能は、このようにしっかりとその微小環境8に連結されています。それにもかかわらず、現在までに、生理的な文脈で、または完全にそのCNS微小環境を複製する方法で、ミクログリアの貪食作用を研究するための標準化アッセイはありません。
いくつかのアッセイは、初代ミクログリアまたはミクログリア細胞株は、標的細胞（ 例えば 、アポトーシスのニューロン）または蛍光標識されたビーズで培養し、インビトロでミクログリアの食作用活性を測定するために開発されてきました。標的取り込みはその後、蛍光イメージング顕微鏡を用いて評価またはサイトメトリー9-12フローです。これらのアッセイは、薬理学的または遺伝的操作が有益ながら、完全に生体内環境での複合体を複製するために失敗し、ミクログリア食作用に影響を与えることができるかのテストを可能にします。ミクログリア食作用を調べるための間接的な方法in vivoで報告されている。これらは、食作用に関与すると考えられ、分子の染色によって達成されている（ 例えば、CD68）、（ 例えば 、妥協ニューロンまたはシナプス要素）食作用のためにミクログリアとターゲットの物理的な近接性を評価する、または食作用の免疫組織化学的検出によって、ミクログリア細胞内標的（ 例えば、Aβ）13-17。二つの研究は、 生体内でミクログリアの貪食作用を評価するために、より直接的なアプローチを使用してきました。ヒューズらは、頭蓋内経路18を介して配信ビーズのミクログリアの取り込みを測定するためのイメージング技術を使用しています。シエラらは、定量的に複雑なイメージング技術4を用いて、アポトーシス細胞のミクログリア食作用を評価するための洗練された方法を開発しました。しかしながら、これらの方法は、組織標本、セクショニング、画像化、および分析のための複雑なプロトコルを含みます。我々は以前外感光体の食作用を評価するためにフローサイトメトリー分析を使用しています文化19における網膜色素上皮（RPE）細胞による小胞体セグメント。ここでは、急速にin vivoでのミクログリアの貪食作用の定量的尺度として網膜ミクログリアにより、蛍光標識された粒子の取り込みを評価するためのプロトコルについて説明します。
蛍光標識された粒子の（1）硝子体内の配信、（2）収穫と網膜組織の準備、および（3）流量：私たちはここで説明するプロトコルは、信頼性が高く、定量的な3つの重要なステップですぐ下に6時間で網膜ミクログリア食作用の測定を可能にしますサイトメトリー分析。我々が開発した方法は網膜におけるミクログリア食作用を評価するための堅牢な方法であり、正常に種々の化合物または遺伝子操作は、生理学的設定でこのキーミクログリアの機能を変化させる方法をテストするために使用することができます。 CNSの専門分野として、網膜ミクログリア機能20を研究するための簡単にアクセスできるモデル系です。この方法は、トンで開発されたが彼の目、我々はそれがミクログリアの貪食機能を調査するすべての神経科学者のために役立つことができると信じています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この方法では3つの重要なステップがあります：蛍光標識された粒子の（1）硝子体内注射; （2）収穫および網膜組織の調製。 （3）フローサイトメトリー分析。私たちは、研究者は、我々がここで紹介する方法を実行する前に硝子体内注射を練習することをお勧めします。アルビノマウス（ 例えば 、BALB / c）および着色した溶液（ 例えば、蛍光標識された粒子）が針と注入した?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
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