La valutazione della retina microglia fagocitaria Funzione<em> In Vivo</em> Usando un test citometria a flusso basato su
Summary
fagocitosi microglia è fondamentale per il mantenimento della omeostasi tissutale e fagocitaria inadeguata è stato implicato nella patologia. Tuttavia, valutare la funzione microglia in vivo è tecnicamente impegnativo. Abbiamo sviluppato una tecnica semplice ma robusto per monitorare e quantificare il potenziale di fagocitosi microglia in un ambiente fisiologico preciso.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di valutare con precisione e quantificare in vivo fagocitosi microglia. Microglia sono i macrofagi tessuto residenti del sistema nervoso centrale (CNS). Essi svolgono una varietà di funzioni per assicurare il mantenimento dell'omeostasi tissutale. Questi includono sorveglianza immunitaria, la secrezione di fattori neurotrofici e, di fondamentale importanza, la fagocitosi 1. Fagocitosi microglia è fondamentale in molti importanti eventi durante lo sviluppo del cervello e della retina, come la fagocitosi delle sinapsi irrilevanti (potatura sinaptica) e la rimozione dei neuroni apoptotici 2-4. Inoltre, fagocitosi microglia dei neuroni danneggiati o apoptotici, detriti cellulari, e microbi ha dimostrato di essere essenziale per il mantenimento dell'omeostasi CNS attraverso adulta 5. Infine, la fagocitosi microglia è stato implicato nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Alzheimer e legata all'etàdegenerazione maculare, dove è stato suggerito che la capacità dei fagociti difettoso o insufficiente può contribuire alla formazione di amiloide beta-placche (Ap) e drusen, rispettivamente 6,7.
la funzione della microglia è strettamente regolata dal loro microambiente, in particolare da fattori solubili come il fattore di crescita tumorale-β o interazioni cellula-cellula. I neuroni costitutivamente esprimono vari ligandi di superficie cellulare, come il CD200 e CX3CL1, mentre microglia esprimono esclusivamente i rispettivi recettori CD200R e CX3CR1. Questi recettori contengono immunoreceptor motivi di inibizione delle tirosin-based (ITIMs) nella loro porzione intracellulare. Questi inibitore recettori sono fondamentali per prevenire l'eccessiva stimolazione della microglia, che può contribuire alla neuroinfiammazione. Così, in condizioni fisiologiche normali, interazioni cellula-cellula tra i neuroni e microglia mantenere microglia in stato di quiescenza. Durante lesioni dei tessuti, tuttavia, i neuroni possono down-regolare expression di tali ligandi, rimuovendo il loro effetto inibitorio sull'attivazione microglia. La funzione della microglia (compresa la fagocitosi) è dunque strettamente legata alla loro microambiente 8. Tuttavia, ad oggi, non esistono test standardizzati per studiare microglia fagocitosi in un contesto fisiologico o in un modo che replica pienamente la loro microambiente CNS.
Diversi test sono stati sviluppati per misurare l'attività fagocitaria dei microglia in vitro, dove microglia primarie o linee cellulari microgliali sono messi in coltura con cellule bersaglio (ad esempio, i neuroni apoptotici) o perline fluorescente. L'assorbimento di destinazione viene poi valutata utilizzando la microscopia a fluorescenza per immagini o citometria a flusso 9-12. Questi test permettono di prova di come la manipolazione farmacologica o genetica può influenzare la fagocitosi microglia e, mentre informativo, non riescono a replicare pienamente il complesso in un ambiente vivo. I metodi indiretti per l'esame fagocitosi microgliain vivo sono stati segnalati: questi sono realizzati mediante colorazione delle molecole si ritiene siano coinvolti nella fagocitosi (ad esempio, CD68), valutando la vicinanza fisica della microglia e obiettivi per la fagocitosi (ad esempio, i neuroni compromessi o elementi sinaptiche), o per la rilevazione immunoistochimica di fagociti obiettivi all'interno delle cellule microgliali (ad esempio, Ap) 13-17. Due studi hanno utilizzato metodi più diretti per valutare microglia fagocitosi in vivo. Hughes e colleghi hanno utilizzato tecniche di imaging per misurare l'assorbimento microglia di perline consegnati per via intracranica 18. Sierra et al. Ha sviluppato un metodo raffinato per valutare quantitativamente microglia fagocitosi delle cellule apoptotiche utilizzando tecniche di imaging complesse 4. Tuttavia, questi metodi comportano protocolli complicati preparazione del tessuto, sezionamento, imaging e analisi. Abbiamo usato in precedenza l'analisi di citometria di flusso per valutare la fagocitosi di fotorecettori fuorisegmenti er di cellule epitelio pigmentato retinico (RPE) nella cultura 19. Qui, descriviamo un protocollo per valutare rapidamente l'assorbimento di particelle fluorescente di microglia retina come una misura quantitativa della microglia in vivo fagocitosi.
Il protocollo che descriviamo qui consente la misurazione affidabile e quantitativa del retinale fagocitosi microgliali in meno di sei ore in tre fasi fondamentali: (1) fornitura intravitreale di fluorescenza etichettati particelle, (2) raccolta e preparazione del tessuto retinico, e (3) Flusso analisi di citometria. Il metodo abbiamo sviluppato un metodo robusto per valutare fagocitosi microglia nella retina, e può essere utilizzato con successo per verificare come vari composti o manipolazione genetica alterano questo tasto funzione microgliali in contesti fisiologici. Come una zona specializzata del SNC, la retina è un sistema modello facilmente accessibile per studiare la funzione microglia 20. Mentre questo metodo è stato sviluppato in tegli occhio, riteniamo possa essere utile per tutti i neuroscienziati che studiano la funzione microglia fagocitaria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono tre passaggi critici in questo metodo: (1) l'iniezione intravitreale di fluorescenza etichettati particelle; (2) la raccolta e preparazione del tessuto retinico; e (3) il flusso citometria. Si raccomanda che i ricercatori praticano iniezioni intravitreali prima di eseguire il metodo che presentiamo qui. Topi albini (ad esempio, BALB / c), e una soluzione colorata (ad esempio, particelle fluorescente) possono essere utilizzati per facilitare la visualizzazione dell'ago e soluzione iniett…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
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