Het beoordelen van het netvlies Microgliale fagocytosefunctietesten<em> In Vivo</em> Met behulp van een flowcytometrie-gebaseerde test
Summary
Microgliale fagocytose is essentieel voor het behoud van weefselhomeostase en onvoldoende fagocytosefunctietesten is betrokken bij pathologie. Echter, het beoordelen van microglia functie in vivo is technisch uitdagend. We hebben een eenvoudige maar robuuste techniek ontwikkeld voor het nauwkeurig bewaken en kwantificeren van de fagocytische potentieel van microglia in een fysiologische omgeving.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
Het algemene doel van deze methode is om nauwkeurig te beoordelen en te kwantificeren in vivo microgliale fagocytose. Microglia de resident macrofagen weefsel van het centrale zenuwstelsel (CNS). Zij voeren verschillende functies onderhoud weefsel homeostase waarborgen. Deze omvatten immuun surveillance, secretie van neurotrofe factoren, en van cruciaal belang, fagocytose 1. Microgliale fagocytose is de sleutel bij diverse belangrijke gebeurtenissen tijdens de ontwikkeling van de hersenen en het netvlies, zoals fagocytose van irrelevante synapsen (pruning) en verwijdering van apoptotische neuronen 2-4. Bovendien heeft microgliale fagocytose van beschadigde of apoptotische neuronen, celafval en microben gebleken essentieel voor het behoud CNS homeostase bij volwassenen, 5 zijn. Tenslotte is microgliale fagocytose geïmpliceerd bij de pathogenese van verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Alzheimer en leeftijdsgebondenmaculaire degeneratie, waar het is gesuggereerd dat defecte of onvoldoende fagocytische capaciteit kan bijdragen aan de opbouw van amyloïd-β (Aß) plaques en drusen respectievelijk 6,7.
Microgliale functie wordt strak gereguleerd door hun micro-omgeving, met name door oplosbare factoren zoals tumor-groeifactor β of cel-cel interacties. Neuronen constitutief uiten verschillende celoppervlak liganden, zoals CD200 en CX3CL1, terwijl microglia uitsluitend de respectievelijke receptoren CD200R en CX3CR1 uiten. Deze receptoren bevatten immunoreceptor op basis van tyrosine motieven (ITIMs) in hun intracellulaire gedeelte. Deze remmer receptoren zijn essentieel voor het voorkomen van de overstimulatie van microglia, die kunnen bijdragen aan inflammatoire processen. Dus onder normale fysiologische omstandigheden, cel-cel interacties tussen neuronen en microglia microglia houden in een rusttoestand. Tijdens weefselbeschadiging echter neuronen downreguleren expression van deze liganden, verwijderen van hun remmend effect op microglia activatie. Microgliale functie (inclusief fagocytose) is dus nauw verbonden met hun micromilieu 8. Evenwel nog, er geen gestandaardiseerde assays microglia fagocytose studeren in een fysiologische omgeving of op een wijze die volledig repliceert het CNS micromilieu.
Verschillende assays zijn ontwikkeld om fagocytische activiteit van microglia in vitro, waarbij primaire of microglia microglia cellijnen gekweekt met doelcellen (bijvoorbeeld apoptotische neuronen) of fluorescerend gemerkte korrels meten. Target opname wordt vervolgens beoordeeld met fluorescerende beeldvorming microscopie of flowcytometrie 9-12. Deze testen laten testen hoe farmacologische of genetische manipulatie microgliale fagocytose van invloed kunnen zijn en, terwijl informatief, niet volledig te repliceren het complex in vivo omgeving. Indirecte methoden voor de behandeling van microgliale fagocytosein vivo gemeld: deze worden uitgevoerd door kleuring van moleculen verondersteld betrokken te zijn bij fagocytose (bijvoorbeeld CD68), meten fysieke nabijheid van microglia en doelen voor fagocytose (bijvoorbeeld gecompromitteerd neuronen of synaptische elementen), of door immunohistochemische detectie van fagocytische doelstellingen binnen microgliacellen (bijvoorbeeld Ap) 13-17. Twee studies hebben meer directe benadering gebruikt om microglia fagocytose te beoordelen in vivo. Hughes en collega's hebben gebruikt beeldvormende technieken om microglia opname van geleverd via de intracraniale route 18 kralen te meten. Sierra et al. Ontwikkelden een verfijnde methode voor een kwantitatieve beoordeling microglia fagocytose van apoptotische cellen met behulp complex beeldvormingstechnieken 4. Echter, deze methoden betrekken ingewikkelde protocollen voor het prepareren van weefsels, snijden, beeldvorming en analyse. We hebben eerder gebruikte flowcytometrische analyse om fagocytose van fotoreceptor uit te beoordelener segmenten door retinale gepigmenteerde epitheel (RPE) cellen in de cultuur 19. We beschrijven hier een protocol opname van fluorescerend gemerkte deeltjes door retinale microglia als kwantitatieve maat van in vivo microglia fagocytose snelle beoordeling.
Het protocol hier beschreven maakt betrouwbare en kwantitatieve meting van retinale microgliale fagocytose in bijna zes uur in drie belangrijke stappen: (1) intravitreale afgifte van fluorescerend gemerkte deeltjes, (2) oogsten en bereiding van retinale weefsel, en (3) stroming cytometrische analyse. De werkwijze die we hebben ontwikkeld is een robuuste methode om microgliale fagocytose beoordelen in de retina, en het kan met succes worden gebruikt om te testen hoe verschillende verbindingen of genetische manipulatie wijzigt deze sleutel microgliale functie fysiologische instellingen. Als gespecialiseerde gebied van het CNS, de retina is een gemakkelijk toegankelijk modelsysteem microglia functie 20 bestuderen. Hoewel deze methode werd ontwikkeld in thij oog, wij geloven dat het kan nuttig zijn voor alle neurowetenschappers onderzoeken van microglia fagocytosefunctietesten zijn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn drie cruciale stappen in deze werkwijze: (1) intravitreale injectie van fluorescent gelabelde deeltjes; (2) het oogsten en de voorbereiding van het netvlies weefsel; en (3) stroom cytometrische analyse. We raden de onderzoekers oefenen intravitreale injecties voorafgaand aan het uitvoeren van de methode die we hier presenteren. Albino muizen (bijvoorbeeld BALB / c) en een gekleurde oplossing (bijvoorbeeld fluorescerend gemerkte deeltjes) kan worden gebruikt voor eenvoudige visualisatie van de n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
