להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em> In vivo</em> שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay
Summary
phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
המטרה הכללית של שיטה זו היא להעריך במדויק ולכמת ב phagocytosis microglial vivo. Microglia הם מקרופאגים תושב רקמות של מערכת העצבים המרכזית (CNS). הם לבצע מגוון של פונקציות כדי להבטיח תחזוקה של הומאוסטזיס רקמות. אלה כוללים מעקב חיסוני, הפרשת גורמי neurotrophic ו, בעל חשיבות מרכזית, phagocytosis 1. Phagocytosis microglial הוא מפתח בכמה אירועים חשובים במהלך ההתפתחות של מוח הרשתית, כגון phagocytosis של סינפסות רלוונטי (גיזום סינפטי) והסרה של נוירונים אפופטוטיים 2-4. יתר על כן, phagocytosis microglial של נוירונים פגומים או אפופטוטיים, פסולת הסלולר, חיידקים פולשים הוכח להיות חיוני לשמירה על הומאוסטזיס CNS לבגרות 5. לבסוף, phagocytosis microglial היה מעורב בפתוגנזה של מספר מחלות ניווניות, כולל מחלת אלצהיימר וגיל הקשורותניוון מקולרי, שם הוצע כי קיבולת phagocytic פגום או לא מספיק עלולים לתרום הצטברות של עמילואיד-β (Aβ) כרזות דרוזן, בהתאמה 6,7.
פונקצית microglial מוסדרת בחוזקה על ידי microenvironment שלהם, בעיקר על ידי גורמים מסיסים כגון β גורם-צמיחת גידול או תאי תאי אינטראקציות. נוירונים constitutively להביע כמה הליגנדים פני התא, כגון CD200 ו CX3CL1, תוך microglia בלעדי להביע את הקולטנים המתאימים CD200R ו CX3CR1. קולטנים אלה מכילים מוטיבי העיכוב מבוסס טירוזין immunoreceptor (ITIMs) בחלק תאיים שלהם. אלה מעכבים קולטניים הם קריטיים למניעת גירוי היתר של microglia, אשר יכול לתרום neuroinflammation. לכן, בתנאים פיסיולוגיים נורמליים, תאים תאים אינטראקציות בין נוירונים microglia לשמור microglia במצב שקט. במהלך פגיעה ברקמות, לעומת זאת, הנוירונים יכול למטה להסדיר expression של ליגנדים אלה, הסרת ההשפעה המעכבת שלהם על הפעלת שריר כלשהו. פונקצית microglial (כולל phagocytosis) ובכך היא קשורה קשר הדוק microenvironment שלהם 8. אף על פי כן, עד כה, אין מבחנים סטנדרטיים ללמוד phagocytosis microglia בהקשר פיסיולוגי או באופן מלא משכפל microenvironment שלהן במערכת העצבים המרכזי.
מבחני כמה פותחו כדי למדוד את פעילות phagocytic של microglia במבחנה, שבו microglia ראשוני או שורות תאים microglia מתורבתים עם תאים היעד (למשל, הנוירונים אפופטוטיים) או חרוזים שכותרתו fluorescently. ספיגת יעד נבחנת מכן באמצעות מיקרוסקופ הדמיה ניאון או cytometry זרימה 9-12. מבחנים אלה מאפשרים בדיקה של כמה מניפולציה תרופתית או גנטית עשויה להשפיע phagocytosis microglial, ובעוד אינפורמטיבי, לא מצליח לשחזר את המורכבות באופן מלא בסביבת vivo. שיטות עקיפות לבחינת phagocytosis microglialin vivo דווח: הם השיגו אלה על ידי מכתים של מולקולות חשבו להיות מעורבים phagocytosis (למשל, CD68), בהערכת קרבה פיזית של המיקרוגליה מטרות עבור phagocytosis (למשל, הנוירונים נפגעים או אלמנטים הסינפטי), או על ידי זיהוי immunohistochemical של phagocytic מטרות בתוך תאי microglial (למשל, Aβ) 13-17. שני מחקרים השתמשו בגישות ישירות יותר להעריך phagocytosis microglia in vivo. יוז ועמיתיו השתמשו בטכניקות הדמיה כדי למדוד ספיגת microglial של חרוזים שיועברו דרך המסלול תוך גולגולתי 18. סיירה et al. פיתח שיטה מעודן להעריך microglia phagocytosis של תאים אפופטוטיים כמותית תוך שימוש בטכניקות הדמיה מורכבות 4. עם זאת, שיטות אלה כרוכים פרוטוקולים מסובכים עבור הכנת רקמה, חתך, הדמיה, וניתוח. השתמשנו בעבר ניתוח תזרים cytometric להעריך phagocytosis של קולטי האור החוצהמגזרים אה באפיתל פיגמנט הרשתית (RPE) התאים בתרבית 19. כאן אנו מתארים פרוטוקול להעריך ספיגת במהירות של fluorescently חלקיקים שכותרתו ידי microglia הרשתית כמו מדד כמותי של phagocytosis microglia in vivo.
הפרוטוקול מתואר כאן מאפשר מדידה אמינה וכמותית של phagocytosis microglial רשתית בתוך פחות משש שעות בשלושה שלבים קריטיים: (1) משלוח intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently, (2) קציר והכנת רקמת רשתית, ו (3) זרימה ניתוח cytometric. השיטה שפתחנו היא שיטה חזקה כדי להעריך phagocytosis microglial ברשתית, והוא יכול לשמש בהצלחה לבחון כיצד תרכובות שונות או מניפולציה גנטית לשנות את תפקוד microglial מפתח זאת בהגדרות פיסיולוגיות. כתוצאה אזור מיוחד של מערכת העצבים המרכזית, הרשתית היא מערכת מודל נגישים בקלות ללמוד microglia פונקציה 20. אמנם שיטה זו פותחה ב tהוא עין, אנחנו מאמינים שזה יכול להיות שימושי עבור כל מדעני מוח חוקרת פונקצית phagocytic microglia.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם שלושה שלבים קריטיים בשיטה זו: (1) הזרקת intravitreal של חלקיקים שכותרתו fluorescently; (2) קציר והכנת רקמת הרשתית; ו (3) ניתוח תזרים cytometric. אנו ממליצים החוקרים לתרגל זריקות intravitreal קודם לביצוע השיטה שאנו מציגים כאן. עכברים לבקנים (למשל, BALB / ג) ופתרון בצבע (למשל, חלקיקים שכ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
- Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
- Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527 (2010).
- Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
- Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
- Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
- Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
- Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
- Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
- Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
- Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196 (2012).
- Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
- Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
- Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
- Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer’s disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
- Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
- Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
- Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
- Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
- Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
- London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
- Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501 (2011).
- Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
- Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
- Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
- Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
- abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
- Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
- O’Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636 (2016).
- Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).
