Die Beurteilung Retinal Microglial Phagozytische Funktion<em> In Vivo</em> Mit einem Durchfluss-Zytometrie basierten Assay
Summary
Mikroglia Phagozytose ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Homöostase von Gewebe und unzureichende phagozytischen Funktion hat in der Pathologie in Verbindung gebracht. Allerdings ist die Bewertung Mikroglia – Funktion in vivo technisch anspruchsvoll . Wir haben eine einfache, aber robuste Technik für die präzise Überwachung entwickelt und die phagozytische Potenzial von Mikroglia in einer physiologischen Umgebung zu quantifizieren.
Abstract
Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer’s and age-related macular degeneration, where amyloid-β plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.
Introduction
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es , genau zu beurteilen und in vivo Mikroglia Phagozytose zu quantifizieren. Mikroglia werden die Gewebe Makrophagen des zentralen Nervensystems (ZNS). Sie führen eine Vielzahl von Funktionen, die Wartung von Gewebshomöostase zu gewährleisten. Dazu gehören Immunüberwachung, Sekretion von neurotrophen Faktoren und von zentraler Bedeutung, Phagozytose 1. Mikroglia Phagozytose ist der Schlüssel in mehrere wichtige Ereignisse während der Entwicklung des Gehirns und der Netzhaut, wie Phagozytose irrelevanter Synapsen (synaptic pruning) und Entfernung von apoptotischen Neuronen 2-4. Weiterhin wurde für die Aufrechterhaltung der Homöostase CNS durch Erwachsenenalter 5 wesentlich zu sein Mikroglia Phagozytose von beschädigten oder apoptotischen Neuronen, Zelltrümmer und eindringenden Mikroben gezeigt. Schließlich hat Mikroglia Phagozytose in der Pathogenese von verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Zusammenhang gebracht, einschließlich Alzheimer-Krankheit und altersbedingteMakula – Degeneration, wo es wurde vermutet , dass defekte oder unzureichende Phagozytosekapazität zum Aufbau von Amyloid-β (Aß) Plaques und Drusen, die jeweils 6,7 beitragen können.
Mikroglia-Funktion wird fest durch ihre Mikroumgebung geregelt, insbesondere durch lösliche Faktoren wie Tumor-Wachstumsfaktor-β oder Zell-Zell-Interaktionen. Neuronen exprimieren konstitutiv mehrere Zelloberflächenliganden, wie beispielsweise CD200 und CX3CL1, während Mikroglia ausschließlich die jeweiligen Rezeptoren CD200R und CX3CR1 exprimieren. Diese Rezeptoren enthalten immunoreceptor Tyrosin-basierte Hemmung Motive (ITIMs) in ihrem intrazellulären Teil. Dieser Inhibitor Rezeptoren sind wichtig zur Verhinderung der Überstimulation der Mikroglia, die neuroinflammation beitragen kann. Somit wird unter normalen physiologischen Bedingungen, Zell-Zell-Wechselwirkungen zwischen Neuronen und Mikroglia halten Mikroglia in einem Ruhezustand. Bei Gewebeverletzungen kann jedoch Neuronen regulieren unten expression dieser Liganden, ihre hemmende Wirkung auf die Mikroglia-Aktivierung zu entfernen. Mikroglia – Funktion (einschließlich Phagozytose) wird so fest an ihrer Mikro – 8 verbunden. Dennoch Bis heute gibt es keine standardisierten Assays Mikroglia Phagozytose in einem physiologischen Kontext oder in einer Weise zu studieren, die vollständig ihre ZNS-Mikroumgebung repliziert.
Phagozytische Aktivität von Mikroglia in vitro zu messen entwickelt, bei denen primäre Mikroglia oder Mikroglia – Zelllinien kultiviert werden , mit den Zielzellen (zB apoptotischen Neuronen) oder fluoreszenzmarkierte Kügelchen mehrere Assays wurden. Zielaufnahme wird dann Fluoreszenz – Imaging – Mikroskopie oder Durchflusszytometrie 9-12 beurteilt werden. Diese Tests ermöglichen Tests, wie pharmakologische oder genetische Manipulation Mikroglia Phagozytose beeinflussen können , und während informativ, nicht in vollem Umfang den Komplex in vivo – Umgebung replizieren. Indirekte Methoden zur Prüfung von Mikroglia Phagozytosein vivo berichtet worden: diese durch Anfärben von Molekülen erreicht werden gedacht , um in Phagocytose beteiligt sein (beispielsweise CD68), die physische Nähe der Mikroglia und Ziele für die Phagozytose (zB kompromittiert Neuronen oder synaptische Elemente) Beurteilung oder durch immunhistochemischen Nachweis von phagozytischen Ziele innerhalb von Mikroglia – Zellen (zB Aß) 13-17. Zwei Studien haben mehr direkte Ansätze verwendet , um Mikroglia Phagozytose in vivo zu beurteilen. Hughes und Kollegen haben Bildgebungstechniken verwendet Mikroglia Aufnahme von Perlen über die intrakranielle Route 18 geliefert zu messen. Sierra et al. Entwickelten eine verfeinerte Methode zur quantitativen Mikroglia Phagozytose von apoptotischen Zellen unter Verwendung komplexer Bildgebungstechniken 4 bewerten. Jedoch umfassen diese Verfahren komplizierter Protokolle zur Gewebevorbereitung, Sektionieren, Bildgebung und Analyse. Wir haben zuvor die durchflusszytometrische Analyse verwendet Phagozytose von Photorezeptor zur Bewertung auser Segmente von retinalen Pigmentepithel (RPE) Zellen in Kultur 19. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur schnellen Beurteilung Aufnahme von fluoreszent markierten Partikel durch retinalen Mikroglia als quantitatives Maß für die in vivo Mikroglia Phagozytose.
Das Protokoll, die wir hier beschreiben, ermöglicht eine zuverlässige und quantitative Messung der retinalen Mikroglia Phagozytose in knapp 6 Stunden in drei kritischen Schritten: (1) intravitreal Lieferung von fluoreszenzmarkierten Teilchen, (2) Ernte und Aufbereitung von Netzhautgewebe, und (3) Strömungs Zytometrie Analyse. Die Methode, die wir entwickelt haben, ist eine robuste Methode Mikroglia Phagozytose in der Retina zu bewerten, und es kann erfolgreich getestet werden, wie verschiedene Verbindungen oder genetische Manipulation dieser Taste Mikroglia-Funktion in physiologischen Einstellungen ändern. Als spezialisierter Bereich des ZNS, ist die Netzhaut ein leicht zugängliches Modellsystem Mikroglia – Funktion 20 zu studieren. Während diese Methode wurde in t entwickeltener Auge, glauben wir, es kann für alle Neurowissenschaftler untersuchen Mikroglia phagozytischen Funktion nützlich sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt drei kritische Schritte in diesem Verfahren: (1) intravitreale Injektion von Teilchen fluoreszierend markiert; (2) Die Gewinnung und Herstellung von Netzhautgewebe; und (3) durchflusszytometrische Analyse. Wir empfehlen, dass die Forscher intravitrealen Injektionen vor der Durchführung des Verfahrens üben wir hier vorstellen. Albino – Mäuse (zB BALB / c) und eine farbige Lösung kann (beispielsweise fluoreszenzmarkierte Partikel) für die einfache Visualisierung der Nadel und injizierten Lö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Salome Murinello is supported by American Diabetes Association grant #1-16-PDF-072. This work was supported by grants to Martin Friedlander from the National Institutes of Health (National Eye Institute EY11254 and EY22025) and the Lowy Medical Research Institute.
Materials
| Stereomicroscope | Nikon | Discontinued | |
| Hamilton syringe, 600 series | Sigma | 26702 | |
| 33 gauge, Small Hub RN NDL, 0.5 in, point style 4 – 12o | Hamilton | 7803-05 | |
| Zymosan A (S. cerevisiae) BioParticles, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher Scientific | Z-23373 | Prepare immediately before injection |
| DPBS | Corning | 21-030-CV | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | Need two |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas Spring Scissors – 3mm Cutting Edge | Fine Science Tools | 15000-10 | Curved |
| Neural Tissue Dissociation Kit – Postnatal Neurons | Miltenyi Biotec | 130-094-802 | |
| 5 mL Polystyrene Round-bottom Tube | Falcon | 352054 | |
| 96 well U-bottom plate | Falcon | 353077 | |
| Stain Buffer (BSA) | BD Biosciences | 554657 | |
| CD11b-BV650 Antibody | BioLegend | 101259 | |
| Ly6C-APC-Cy7 | BioLegend | 128025 | |
| Ly6G-PE-Cy7 | BioLegend | 127617 | |
| Propidium Iodide | BD Biosciences | 556463 | |
| Purified anti-mouse CD16/32 Antibody | BioLegend | 101301 |
References
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