Burada in vitro propriyospinal bağlantıları işlevsel rejenerasyonu çalışma çoklu elektrot dizileri üzerinde kültürlü omurilik dilimleri dayanan bir protokol mevcut.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Merkezi sinir sisteminde (CNS) Organotipik dilim kültürler nöron gelişmeden nörodejenerasyona ulaşan muhtelif fizyolojik ve patolojik fenomenler incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrışmış hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, organotipik dilim sağlam bir hücre mimarisini ve yerel sinaptik devresi ile daha fazla karmaşıklık avantajı sunuyoruz. Aynı zamanda, dokuya in vivo bağlamda bütünün karışıklık bulaştırmak için gerek kalmadan bir izole edilmiş şekilde analiz edilebilir. Ayrıca, tercih edilen hücrelere kolay ve tekrar erişim garanti edilir hücre dışı ortamı hassas bir şekilde kontrol edilebilir ve genellikle in vitro modelleri, in vivo göre daha az maliyetlidir. Son yıllarda, çeşitli çalışmalar mukabil yaşayan hayvanların 1,2 karşı uzun vadeli kültürlerinin gelişim profiller arasında çarpıcı benzerlikler sundu. Çeşitli merkezi sinir sistemi regio bu nöronal devreler gösterilmiştirns geliştirme sırasında spontan ağ etkinliğini ifade ve organotipik dilimleri kısmen bu fenomeni 3 -7 korumak. İzole spinal kord hazırlıkları özellikle ritim nesil 6 ve nöronal devrelerin 1 oluşumunu araştırmak için kullanılmıştır.
Organotipik dilim spontan aktivite kayıt için bir yol çoklu elektrot diziler (ÇÇA) üstünde kültürüne onları etmektir. Bu cihazlar çok sayıda eşzamanlı hücreleri (multi-unit kayıt) aksiyon potansiyelleri tarafından oluşturulan hücre dışı potansiyelleri izleyebilirsiniz birden elektrotlar içerir. MEA kayıtları yüksek zamansal çözünürlüğü verilen nöronal devrenin içinde kesin aktivite dinamiklerini yeniden kullanılabilir. Ayrıca, aksine yama-sıkma tekniği nöronlar davranışlarında etkilenmez gerçeği uzun vadeli ölçümleri ve sonuçları izin veren, non-invaziv olduğunu.
Fya da Bu çalışmanın amacı, omurilik organotipik ko-kültür ve çoklu kayıtları kombinasyonu omurilik içinde fonksiyonel rejenerasyon araştırmak için kullanıldı. Yetişkin yüksek omurgalıların omuriliğin hasar kurtarmak için potansiyeli sınırlı olduğundan, farklı stratejiler omurilik yaralanması sonrası rejenerasyon teşvik etmek çalışılmıştır. Şimdiye kadar, kortikospinal yolu genellikle bu tür soruşturmaların için seçim model sistem olmuştur. Bu deneyler genellikle zaman alıcı, pahalı ve sonucu tek gruplar içinde yüksek değişkenliğe büyük hayvan kohortlardan gerektirir. Dahası, kanıt propriyospinal bağlantıları (tamamen omurilik içinde sınırlıdır nöronlar) omurilik lezyonları 8 Aşağıdaki toparlanma sürecine çok önemli bir rol oynayabilir düşündürmektedir. Bu elyaflar artan ve elyaf yolları azalan müdahalesi olmadan, in vivo çalışma zordur. Bonnici ve Kapfhammer 9, uzunlamasına omurilik kullanılanalternatif bir yaklaşım olarak doğum sonrası farelerin dilim kültürleri. Mekanik lezyonlar yaptıktan sonra onlar yarı kantitatif omurilik segmentleri arasında akson morfolojik rejenerasyonu analiz. Onlar olgun yaşta kesilen kültürlerde lezyon sitesini kapısı az değil hiçbiri aksonlar gözlemlenmiştir. 7 gün sonra, hasar – Buna karşılık, daha genç bir aşamada lezyonlu sonunda kültürler 5 aksonal rejenerasyon yüksek miktarda gösterilir. Ancak, fonksiyonel bağlantıları için kanıt sundu değildi.
Bu nedenle, fonksiyonel rejenerasyon soruşturma sağlar propriyospinal liflerin vitro model bir temsilcisi gelişimi omurilikte rejeneratif süreçleri ile ilgili bilgimizi genişletmek için değerli bir araç olabilir.
Sunulan prosedürde çeşitli unsurlar doğru ve tekrarlanabilir deneyler başarı için esastır. ÇÇA'lar, çözeltilerin hazırlanması ve dilim kültürlerinin üretimi sırasında tüm adımlar bir laminer akış başlığı içinde steril koşullar altında gerçekleştirilir. Onlar kendiliğinden aktiviteyi 14 etkileyebilir çünkü antibiyotikler besin ortamına uygulanmaz. MEA kaplama sırasında, en önemli kısmı ekstrasellüler matriks jel çözüm her zaman soğuk kalır emin olmaktır. Buzdolabında ve tüm işlem için buz üzerinde tutmak o çözülme 0 ° C'ye yakın bir maksimal sıcaklığını sağlamak için. Buz soğuk diseksiyon tamponlar kullanarak düşük sıcaklığa dilim hızlı izolasyon ve kesit hazırlanması yanı sıra ödeme dikkat sırasında sağlıklı kültürlerin yüzdesini arttırır. Ayrıca, plazma / trombin koagülasyon en kritik adımlardan biridir. İlk olarak, plazma düzgün Mixe emin oluntrombin d. İkinci olarak, ÇÇA için dilimler düzgün eki sağlamak için mümkün olduğunca fazla kalıntı kaldırılması için özel dikkat. Bu adım son derece zaman duyarlıdır; zaman çerçevesi çok kısa ise, plazma / trombin karışımı çok fazla kaldırılır. Zaman çerçevesi çok uzunsa, pıhtılaşma zaten artık plazma / trombin ile birlikte dilimleri kaldırarak riskini artıran oldu.
Mekanik lezyonlar planlanan, bu doğru bir tasarıma sahip ÇÇA kullanmak önemlidir. Lezyon amaçlanan alan elektrotlar, teller ve yalıtımın serbest olması gerekir. Aksi takdirde, MEA elektrik hasarlı ve bu nedenle, hiçbir kayıtlar artık yapılabilir gidiyoruz.
Başka önemli bir adım lezyonun boyutunu ilgilidir. Bu lezyon sonrası iki genç dilim bağlamadan iki gün 10 alır, daha önce gösterilmiştir. Tüm deneyler için, kural uzay betwe olduğu kullanıldılezyon sonrası dilimleri en MEA oluk (300 um) genişliğinden daha büyük olması gerekir. Lezyon hiçbir yeniden bağlanma hiç, çok büyük ise A büyük lezyon boyutu, yeniden bağlanma için daha uzun bir zaman dilimi içinde sonuçlanabilir veya olabilir. Açıklama, eski deneyler ortaya koyduğu çok düşük bağlantı hızı bir başlangıç iki dilim yerleştirilmesi daha uzağa 1 mm'den sonuçları.
Bunun yerine kuluçka 37 ° C kayıtları, oda sıcaklığına kadar, en az 10 dakikalık bir ayar süresi, başlamasından önce, ve hücre dışı çözeltiye yerine yetiştirme ortamı önerilmektedir. Bu ilk dakika boyunca faaliyet desen yakın gözlem ölçülen veri kayıt başlandı uygun sonra kültür patlaması modelini temsil sağlar.
Aktivite, veri toplama ve ileri işleme tespiti için, ev yapımı donanım, Lab programları (, amplifikatörler ve amplifikatörler bağlantıları odasına kayıt)GÖRÜNTÜSÜ, C ++, IgorPro kullanılır. Ticari MEA kurulumları ve diğer yazılım paketleri bu işlemler için de uygundur. Burada, elektrotlar tarafından görülen sinyaller 1001 defa büyütülmüş ve daha sonra 6 kHz hızında dijitalize edilmiştir.
In vivo, onlar artan ve lif yolları azalan müdahalesi olmadan çalışmak zordur, çünkü sunulan model propriyospinal bağlantıları incelemek için yararlı bir araç olabilir. İki omurilik dilim eş kültür zarif bu sorunu aşmak olabilir. Kültürler sıkı kontrol ve kolayca manipüle edilebilir bir mikro sağlamak. Öte yandan, Supraspinal ve duyusal giriş eksik tabii ki. Buna ek olarak, kültür hazırlama süreci CNS hasar durumu temsil etmektedir. Astrositler ve mikroglia gibi glial hücreler, bu nedenle artan proliferasyon ve lezyonlarda yanıt bilinmektedir, doku yeniden bir ölçüde olduğunu. Sunulan moda İlişkinmekanik lezyonlar gerçekleştirdikten sonra l glial skar oluşumu gözlenmemiştir. Bir açıklama astrositlerden adaptif mekanizmalar zaten hazırlık sürecinde tetiklenen olduğunu ve kültürlerin lezyonları daha da tepkiye neden olmadığını olabilir. Ayrıca, myelin ilişkili inhibitörlerinin katılımı için, örneğin herhangi bir kanıt yoktur., Nogo-A, eski bir yaşta lezyonlu kültürlerin düşük rejenerasyon potansiyeli. Bununla birlikte, Rolipram, dilim 10 arasında 23 DIV artar fonksiyonel rejenerasyon lezyon gerçekleştirdikten sonra, başlangıçtan fosfodiesteraz 4 inhibitörü ile muamelenin gördü. Bu sonuçlar, fonksiyonel iyileşme eski kültürlerde artabilir göstermektedir. Lezyon sitesini kapısı akson sayısını sayarken Gözle, genç yaşta Lezyonlu kültürler ve eski bir yaşta lezyonlu kültürler arasında hiçbir fark tespit edilmiştir. Bu bulgular aksonal rejenerasyon bu eksikliği en önemli nedeni f değil önermekveya bu nedenle kültür geç lezyonlardan sonra iyileşme kaybı ve yenilenme fonksiyonel analiz sağlayan bir model için gerekliliğini vurgulamaktadır. Sinaptik oluşumu ve sinaptik plastisite kurtarma işlemi 10 önemli bir rol oynayabilir. Bu mekanizmalar son yıllarda çok ilgi kazandı ve günümüzde yaygın olarak onlar omurilik hasarı sonrası sonucun üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu kabul edilmektedir. Bu nedenle, izolasyon ve çok detaylı bu süreçleri araştırmak için kararlı şartları sağlayan bir model kesinlikle omurilik fonksiyonel dönüşüm konusunda fikir edinmek için yardımcı olabilir.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |