Ici, nous présentons un protocole qui est basée sur des tranches de moelle épinière en culture sur des réseaux multi-électrode à étudier la régénération fonctionnelle de connexions propriospinaux in vitro.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Cultures organotypique du système nerveux central (SNC) ont été largement utilisés pour étudier divers phénomènes physiologiques et pathologiques allant de développement neuronal à la neurodégénérescence. Par rapport à des cultures de cellules dissociées, des tranches organotypiques offrent l'avantage d'une plus grande complexité avec un cytoarchitecture intact et un circuit synaptique local. Dans le même temps, le tissu peut être analysée de façon isolée, sans la nécessité de mettre en cause la complexité de l'ensemble du contexte dans vivo. De plus, un accès facile et répété pour les cellules de choix est justifié, à l'environnement extra-cellulaire peut être contrôlée avec précision et, en général, des modèles in vitro sont moins coûteux que leurs homologues in vivo. Au cours des dernières années, diverses études présentées similitudes frappantes entre les profils de développement des cultures à long terme par rapport aux animaux vivants correspondante 1,2. Il a été montré que les circuits de neurones du SNC de divers regions expriment l'activité de réseau spontané au cours du développement et que les tranches organotypiques maintenir partiellement ce phénomène 3 -7. Préparations isolées de la moelle épinière ont été particulièrement utilisées pour étudier la production de rythme 6 et la formation des circuits neuronaux 1.
Un moyen d'enregistrer l'activité spontanée de tranches organotypiques est à la culture sur le dessus de tableaux multi-électrodes (AME). Ces appareils contiennent de multiples électrodes qui peuvent surveiller les potentiels extracellulaires générés par les potentiels d'action à partir de nombreuses cellules simultanément (enregistrement multi-unité). La haute résolution temporelle des enregistrements MEA peut être utilisée pour reconstruire la dynamique d'activité précis dans un circuit neuronal donné. En outre, contrairement à la pièce de serrage technique est non invasive, qui permet des mesures et les résultats à long terme dans le fait que les neurones ne sont pas affectés dans leur comportement.
Fou les besoins de cette étude, la combinaison de la moelle épinière co-cultures organotypiques et enregistrements multisite a été utilisé pour étudier la régénération fonctionnelle au sein de la moelle épinière. Depuis adultes vertébrés supérieurs ont le potentiel pour récupérer des dommages de la moelle épinière limité, différentes stratégies ont été étudiées pour favoriser la régénération après une lésion de la moelle épinière. Jusqu'à présent, le faisceau cortico-spinal a généralement été le système de modèle de choix pour ces enquêtes. Ces expériences sont généralement beaucoup de temps, coûteux et nécessitent de grandes cohortes d'animaux en raison de la forte variabilité au sein des groupes simples. En outre, il semble que les connexions propriospinaux (neurones qui sont entièrement confinés à l'intérieur de la moelle épinière) peuvent jouer un rôle central dans le processus de récupération suite à des lésions de la moelle épinière 8. Ces fibres sont difficiles à étudier in vivo sans l'interférence de monter et descendre des faisceaux de fibres. Bonnici et Kapfhammer 9 utilisés moelle épinière longitudinalecultures tranche de souris postnatales comme une approche alternative. Après avoir effectué les lésions mécaniques, ils ont analysé semi-quantitative de la régénération des axones morphologique entre les segments de la moelle épinière. Ils ont observé moins, mais pas Aucun axones traversant le site de la lésion dans les cultures coupées à un âge mûr. En revanche, les cultures qui ont été lésés à un stade jeune affichent une grande quantité de régénération axonale 5 – 7 jours après le dommage. Toutefois, la preuve pour les connexions fonctionnelles n'a pas été présenté.
Par conséquent, le développement d'un représentant dans le modèle in vitro de fibres propriospinaux qui permet à l'enquête de la régénération fonctionnelle peut être un outil précieux pour étendre nos connaissances sur les processus de régénération de la moelle épinière.
Plusieurs éléments de la procédure présentée sont fondamentales pour la réalisation d'expériences précises et reproductibles. Toutes les étapes au cours de la préparation des solutions AEM, et la production des cultures de tranches sont effectuées dans des conditions stériles sous une hotte à flux laminaire. Les antibiotiques ne sont pas appliqués au milieu nutritif, car ils peuvent affecter l'activité spontanée 14. Pendant le revêtement de MEA, la partie la plus importante est de faire en sorte que la solution de gel de la matrice extracellulaire reste froid en tout temps. Décongeler au réfrigérateur et de garder sur la glace pendant toute la procédure pour assurer une température maximale proche de 0 ° C. Lors de la préparation de l'isolement rapide et tranches sectionnement, ainsi que de prêter attention à une basse température en utilisant la glace froid tampons de dissection augmente le pourcentage des cultures saines. De plus, le plasma / coagulation de la thrombine est l'une des étapes les plus critiques. Tout d'abord, assurez-vous que le plasma est correctement Mixed avec la thrombine. Deuxièmement, accorder une attention particulière à l'élimination autant de résidus que possible pour assurer une bonne fixation des tranches aux AME. Cette étape est extrêmement sensible au temps; si le délai est trop court, trop de mélange plasma / de la thrombine est retiré. Si le délai est trop long, la coagulation est déjà arrivé, augmentant le risque de retirer les tranches avec le résiduel plasma / thrombine.
Si les lésions mécaniques sont prévues, il est important d'utiliser AME avec une conception précise. La zone où la lésion est destiné doit être libre d'électrodes, fils et l'isolation. Sinon, le système électrique de la MEA vont être endommagé et, par conséquent, aucun enregistrement ne peut être effectué plus.
Une autre étape cruciale concerne la taille de la lésion. Il a été montré précédemment que la reconnexion deux jeunes tranches après lésion dure environ deux jours 10. Pour toutes les expériences, la règle de base a été utilisé que le chic de l'espaceen tranches après lésion ne doit pas être plus grand que la largeur de la rainure de la MEA (300 um). Une plus grande taille de la lésion peut entraîner un délai plus long pour la reconnexion ou, si la lésion est trop grand, aucune reconnexion du tout. Pour annoter, expériences antérieures ont révélé qu'une mise initiale de deux tranches plus loin que 1 mm donne un taux de connexion très faible.
Avant le début des enregistrements, un trajet de réglage d'au moins 10 min à la température ambiante, au lieu de 37 ° C de l'incubateur, et à la solution extracellulaire, à la place du milieu de nutrition est recommandée. Une observation attentive de la configuration de l'activité au cours de ces premières minutes assure que les données de mesure représentent le motif d'éclatement de la culture de manière appropriée après que l'enregistrement a commencé.
Pour la détection de l'activité, l'acquisition des données et le traitement ultérieur, le matériel fait maison (chambre d'enregistrement, les connexions aux amplificateurs et amplificateurs), les programmes en laboratoireVUE, C ++ et IgorPro sont utilisés. Configurations de MEA commerciales et d'autres logiciels sont adaptés aussi bien pour ces opérations. Ici, les signaux vus par les électrodes sont amplifiés 1001 fois, et ensuite numérisées à un débit de 6 kHz.
Le modèle présenté peut être un outil utile pour examiner les connexions propriospinaux parce in vivo, ils sont difficiles à étudier sans interférence de monter et descendre des faisceaux de fibres. La co-culture de deux tranches de la moelle épinière peut élégamment contourner ce problème. Les cultures fournissent un microenvironnement qui peuvent être étroitement contrôlée et facilement manipulé. D'autre part, l'entrée supraspinal et sensorielle est bien sûr absent. En outre, le procédé de la préparation de culture représente une situation de détérioration du système nerveux central. Les cellules gliales telles que les astrocytes et la microglie sont connus pour répondre à des lésions avec une prolifération accrue et, par conséquent, le tissu est dans une certaine mesure réorganisée. Relatif au mode présentél la formation d'une cicatrice gliale après avoir effectué des lésions mécaniques n'a pas été observée. Une explication pourrait être que les mécanismes d'adaptation des astrocytes ont déjà été déclenchés pendant le processus de préparation et que les lésions des cultures n'a pas abouti à une autre réponse. En outre, il n'y a aucune preuve de la participation des inhibiteurs associés de la myéline, par exemple., Nogo-A, dans le potentiel de régénération des cultures à faible lésés à un âge avancé. Cependant, il a été montré que le traitement avec l'inhibiteur de la phosphodiestérase 4 rolipram, en commençant directement après l'exécution de lésions à 23 DIV augmente la régénération fonctionnelle entre les 10 tranches. Ces résultats démontrent que la récupération fonctionnelle peut être augmentée dans les vieilles cultures. Sensiblement, lors du comptage du nombre d'axones qui traversent le site de la lésion, pas de différence entre les cultures lésés à un jeune âge et les cultures lésés à un âge avancé a été découvert. Ces résultats suggèrent que le manque de régénération axonale est pas la raison majeure fou la perte de la récupération après lésions tardives dans la culture et donc souligner la nécessité d'un modèle qui permet l'analyse fonctionnelle de la régénération. Formation synaptique et la plasticité synaptique pourraient jouer un rôle majeur dans le processus de récupération 10. Ces mécanismes ont gagné beaucoup d'attention au cours des dernières années et il est aujourd'hui largement admis que ils ont un impact majeur sur le résultat après une blessure de la moelle épinière. Par conséquent, un modèle qui offre des conditions stables pour enquêter sur ces processus dans l'isolement et dans les moindres détails peut certainement aider à obtenir un aperçu sur la régénération fonctionnelle dans la moelle épinière.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |