여기에서 우리는 체외에서 propriospinal 연결 기능 재생을 연구하기 위해 다중 전극 배열에 배양 척수 조각을 기반으로하는 프로토콜을 제시한다.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
중추 신경계 (CNS)의 Organotypic 슬라이스 배양 신경 발달의 신경 퇴행에 도달하는 다양한 생리 학적 및 병리학 적 현상을 연구하기 위해 광범위하게 사용되어왔다. 해리 된 세포 배양에 비해의 Organotypic 슬라이스 그대로 cytoarchitecture와 로컬 시냅스 회로가 더 많은 복잡성 이점을 제공한다. 동시에, 조직이 생체 내 환경에서의 전체적인 복잡함 연루 않고도 격리 방법으로 분석 될 수있다. 또한, 선택의 세포에 쉽게 반복 액세스, 보증 세포 외 환경을 정밀하게 제어 할 수 있고, 보통, 체외 모델은 생체에 비해 저렴하다. 최근 몇 년 동안, 다양한 연구는 대응하는 살아있는 동물, 2 대 장기 문화의 발달 프로파일 사이에 놀라운 유사성을 발표했다. 다양한 중추 신경계 레지오의 신경 회로를 보여왔다NS는 개발 과정에서 자발적인 네트워크 활동을 표현하고의 Organotypic 조각은 부분적으로 이러한 현상 3 -7을 유지하는 것이다. 격리 척수 제제가 특히 리듬 생성 회로 (6)과의 연결 (1)의 형성을 조사하는데 사용되어왔다.
슬라이스의 Organotypic 자발적인 활동을 기록 할 수있는 방법은 멀티 – 전극 어레이 (다자간)의 상단에이를 배양하는 것이다. 이 장치는 다수의 동시 세포 (멀티 유닛 녹음)에서 활동 전위에 의해 생성 된 세포 외 잠재력을 모니터링 할 수있는 여러 전극이 포함되어 있습니다. MEA 레코딩 높은 시간 해상도는 주어진 신경 회로에서 정확한 활성 역학을 재구성하는데 사용될 수있다. 또한, 달리 패치 클램프 기술은 뉴런의 행동에 영향을받지 않도록 사실상 장기 및 측정 결과를 허용하는 비 침습적이다.
F또는 본 연구의 목적은 척수의 Organotypic 공동 배양 및 다중 기록의 결합은 척수 내의 재생 기능을 조사하기 위해 사용 하였다. 성인 높은 척추 동물은 척수의 손상으로부터 회복 할 가능성이 제한되어 있기 때문에, 다양한 전략이 척수 손상 후 재생을 촉진하기 위해 연구되어왔다. 지금까지, 피질 관은 일반적으로 연구를 위해 선택한 모델 시스템이었다. 이러한 실험은 일반적으로 시간이 많이 소요, 비용이 많이 드는 인해 하나의 그룹 내 높은 변동성에 큰 동물 동료를 필요로한다. 또한, 증거 propriospinal 연결 (전적으로 척수 내에 갇혀 뉴런) 척수 병변 8 다음 복구 과정에서 중요한 역할을 수행 할 수 있음을 시사한다. 이 섬유는 상승과 섬유 책자를 내림차순의 간섭을받지 않고 생체 내에서 공부하기가 어렵습니다. BONNICI 및 Kapfhammer 9 종 척수를 사용다른 방법으로 출생 후 마우스의 슬라이스 문화. 기계적인 병변을 수행 한 후 그들은 반 정량적으로 척수 세그먼트 사이 축삭의 재생 형태를 분석 하였다. 그들은 성숙한 나이에 컷 문화 병변 사이트를 건너 적은 있지만 없음 축색 돌기를 관찰했다. 7 일 피해 후 – 반면, 젊은 단계에서 병변 된 문화는 5 축삭 재생의 높은 금액을 표시. 그러나 기능적인 연결을위한 증거는 제시되지 않았다.
따라서, 기능 중생의 조사를 허용 propriospinal 섬유의 체외 모델의 대표의 개발은 척수의 재생 프로세스에 대한 우리의 지식을 확장 할 수있는 유용한 도구가 될 수 있습니다.
제시된 절차의 여러 요소가 정확하고 재현성있는 실험의 성과에 대한 기본적인. MEA의, 용액의 제조 및 슬라이스 배양 물의 제조시 모든 단계는 층류 후드에서 멸균 조건 하에서 수행된다. 그들은 자발적인 활동 (14)에 영향을 미칠 수 있기 때문에 항생제는 영양 배지에 적용되지 않습니다. MEA 코팅시, 가장 중요한 부분은 세포 외 기질 겔 용액 항상 차가운 유지하는지 확인하는 것입니다. 냉장고에 전체 절차 얼음에 보관은 해동은 0 ℃에 가까운 최대 온도를 확인합니다. 빙냉 해부 버퍼를 사용하여 저온 슬라이스 빠른 분리 및 절편의 제조뿐만 아니라, 신경을 쓰는 동안 건강 문화의 비율을 증가시킨다. 또한, 플라즈마 / 트롬빈 응고는 가장 중요한 단계 중 하나이다. 첫째, 플라즈마가 제대로 mixe 있는지 확인트롬빈와 D. 둘째, MEA의 슬라이스에 적절히 부착되도록 최대한 잔사를 제거하기에 특히주의. 이 단계는 매우 시간에 민감한입니다; 기간이 너무 짧으면, 혈장 / 트롬빈 혼합물을 너무 많이 제거한다. 기간이 너무 길면, 응고 이미 잔여 혈장 / 트롬빈과 함께 조각을 제거하는 위험을 증가 일어났다.
기계적인 병변을 계획하는 경우에는, 그것은 정확한 디자인을 가진 MEA를 사용하는 것이 중요하다. 병변 의도 지역은 전극, 배선 및 절연의 자유를 필요로한다. 그렇지 않으면, MEA의 전기가 손상 될 수 있으므로, 어떤 기록이 더 이상 수행 할 수없는 것입니다.
다른 중요한 단계는 병변의 크기에 관한 것이다. 그것은 병변 후 두 젊은 조각을 다시 연결하는 것은 이틀 10 걸리는 이전에 표시되었습니다. 모든 실험을 위해, 엄지 손가락의 규칙은 공간 betwe 것을 사용병변 후 조각 엉 MEA 홈 (300 μm의)의 폭보다 더 큰이어야한다. 병변이 더 재 연결이 전혀 너무 큰없는 경우 더 큰 병변의 크기, 재 연결을위한 긴 시간 프레임에서 발생 또는 수 있습니다. 주석, 전 실험 밝혀 그 매우 낮은 연결 속도에 초기 두 조각의 배치에 더 멀리보다 1mm 결과.
대신 인큐베이터 37 ° C의 녹음, RT 적어도 10 분의 조정 시간의 시작하기 전에, 그리고 세포 외 용액에 대신 영양 매체의 권장합니다. 이러한 초기 분 동안의 활동 패턴의 확대 관찰 측정 된 데이터는 기록이 시작된 적절 후 문화의 붕괴의 패턴을 나타내는 것을 보장한다.
활동, 데이터 수집 및 추가 처리의 검출을 위해, 제 하드웨어는 랩의 프로그램 (증폭기 및 증폭기에 연결 실 촬영)보기, C ++ 및 IgorPro이 사용된다. 상업 MEA의 설정 및 기타 소프트웨어 패키지는 이러한 작업뿐만 아니라 적합합니다. 여기서, 전극 볼 신호는 1,001 배 증폭하고 6 kHz의 속도로 디지털화된다.
생체 내에서, 그들은 상승 및 섬유 책자를 내림차순의 간섭을받지 않고 공부하기 어려운 있기 때문에 제시된 모델은 propriospinal 연결을 검사 할 수있는 유용한 도구가 될 수 있습니다. 두 척수 조각의 공동 배양은 우아하게이 문제를 회피 할 수 있습니다. 배양 물은 엄격하게 제어하고 쉽게 조작 할 수있는 미세 환경을 제공한다. 한편, 척 주상과 감각 입력은 누락 물론이다. 또한, 문화의 제조 프로세스는 CNS 손상 상황을 나타낸다. 성상 세포 및 미세 아교 세포와 같은 신경 교세포가 따라서 증가 된 증식과 함께 병변에 반응하는 것으로 알려져있다, 조직 재구성 어느 정도이다. 제시된 모드에 관한기계적인 병변을 수행 한 후 L 교세포 반흔의 형성은 관찰되지 않았다. 한 설명은 성상 세포의 적응 메커니즘이 이미 준비 과정이 트리거되었는지와 문화 병변 상기 반응에 포함되지 않은 것일 수있다. 또한, 수초 관련 억제제의 참여, 예에 대한 증거가 없다., 노고, 나이에 병변 문화의 낮은 재생 가능성이있다. 그러나, 롤 리프 람이, 조각 (10) 사이에 23 DIV 증가 기능 재생에 병변을 수행 한 후 바로 시작하는 포스 포 디에스 4 억제제가 치료를 줬습니다. 이 결과는 기능 회복이 오래 배양에서 증가 될 수 있음을 보여준다. 병변 사이트를 건너 축색 돌기의 수를 계산하는 경우에 띄게, 젊은 나이에 병변 문화와 나이에 병변 문화 간의 차이는 발견되지 않았다. 이러한 연구 결과는 축삭 재생의 부족이 주요 이유 F없는 제안따라서 또는 배양 후반 병변 후 회복 손실 및 재생의 기능적 분석을 가능 모델에 대한 필요성을 강조한다. 시냅스 형성과 시냅스는 복구 프로세스 (10)에서 중요한 역할을 할 수있다. 이러한 메커니즘은 최근 몇 년 동안 많은 관심을 받고 있으며 현재 널리들이 척수 손상 후의 결과에 큰 영향을 미칠 것으로 받아 들여진다. 따라서, 격리 및 훌륭한 세부 사항에 이러한 프로세스를 조사하기 위해 안정된 조건을 제공하는 모델은 확실히 척수 기능 회복에 대한 통찰력을 얻을하는 데 도움이 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |