Здесь мы приводим протокол, основанный на срезах спинного мозга культивировали на нескольких матриц электродов для изучения функциональной регенерации проприоцептивных соединений в пробирке.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
Органотипической срез культуры центральной нервной системы (ЦНС) широко используются для изучения различных физиологических и патологических явлений идущие от нейронов развития с нейродегенерацией. По сравнению с культурами клеток диссоциированных, органотипической ломтики имеют преимущество большей сложностью с интактной цитоархитектуры и местного синаптической схемы. В то же время, ткань может быть проанализирована в изолированной форме без необходимости вовлечь Сложность в целом в естественных условиях. Кроме того, легко и повторил доступ к клеткам выбора является оправданным, внеклеточный среда может быть точно контролировать и, как правило, модели, в пробирке являются менее дорогостоящими, чем их коллеги в естественных условиях. В последние годы, различные исследования представлены поразительные сходства между профилями развития долгосрочных культур по сравнению с аналогичным живых животных 1,2. Было показано, что нейрональные цепей различного ЦНС регио-нс выразить спонтанную сетевую активность в ходе развития и органотипической ломтики частично сохранить этот феномен 3 -7. Изолированные препаратах спинного мозга были особенно используется для исследования генерации ритма 6 и формирование нейронных цепей 1.
Способ записи спонтанной активности органотипических срезов культуры их сверху мульти-электродных массивов (МПС). Эти устройства содержат несколько электродов, которые могут контролировать внеклеточные потенциалы, генерируемые потенциалов действия из многочисленных клеток одновременно (многоквартирных записи). Высокая временное разрешение МПС записей может быть использован для восстановления динамики точные деятельности в пределах данной нейронной цепи. Кроме того, в отличие от патча зажима технику является неинвазивным, которая позволяет долгосрочные результаты измерений и в том, что нейроны не влияет на их поведение.
Fили цель данного исследования, сочетание органотипических спинного мозга сокультурах и многоузловых записей был использован для исследования функционального регенерацию в спинном мозге. Так взрослых высших позвоночных были ограниченный потенциал, чтобы оправиться от повреждения спинного мозга, различные стратегии были изучены, чтобы способствовать регенерации после повреждения спинного мозга. Пока Кортикоспинальных тракта, как правило, был моделью система выбора для таких исследований. Эти эксперименты, как правило, отнимает много времени, дорогим и требует больших когорт животных из-за высокой изменчивости в пределах одной группы. Кроме того, данные свидетельствуют о том, что проприоцептивных соединения (нейроны, которые полностью заключенных внутри спинного мозга) могут играть ключевую роль в процессе восстановления после повреждений спинного мозга 8. Эти волокна трудно учиться в естественных условиях без вмешательства восходящих и нисходящих волокон трактаты. Bonnici и Kapfhammer 9 используется продольный спинной мозгломтик культуры послеродовых мышей в качестве альтернативного подхода. После выполнения механические повреждения они проанализировали полуколичественно морфологическое восстановление аксонов между сегментов спинного мозга. Они наблюдали, но не менее ни один аксоны, пересекающих сайт поражения в культурах, вырезанных в зрелом возрасте. В отличие от этого, культур, которые были повреждениями в молодом этапе отображается большое количество регенерации аксонов 5 – 7 дней после повреждения. Тем не менее, доказательство функциональных связей не была представлена.
Таким образом, развитие представителя в модели пробирке проприоцептивных волокон, позволяет исследовать функциональное регенерации может быть ценным инструментом для расширить наши знания о регенеративных процессов в спинном мозге.
Некоторые элементы в представленном порядке являются основополагающими для выполнения точных и воспроизводимых экспериментов. Все шаги во время подготовки МПС, решения и производства срез культуры осуществляется в стерильных условиях в ламинарном боксе. Антибиотики не применяются к питательной среде, потому что они могут влиять на спонтанную активность 14. Во время MEA покрытия, наиболее важной частью является, чтобы убедиться, что решение внеклеточный матрикс геля остается холодной на все времена. Оттепели в холодильник и держать его на льду в течение всей процедуры, чтобы обеспечить максимальную температуру, близкую к 0 ° С. В ходе подготовки ломтиков быстрого выделения и срезов, а также обращая внимания на низкой температуре с помощью льда холодные буферы рассечение увеличивает процент здоровых культур. Кроме того, плазма / тромбина коагуляции является одним из наиболее важных шагов. Во-первых, убедитесь, что плазма правильно михеd с тромбина. Во-вторых, обратить особое внимание на удаление столько остатка, как это возможно, чтобы обеспечить надлежащее крепление ломтиками в МПС. Этот шаг является чрезвычайно чувствительным ко времени; Если временной интервал слишком короток, слишком много плазмы / тромбина смеси удаляется. Если сроки слишком долго, коагуляция уже произошло, увеличивая риск удаления ломтики вместе с остаточной плазмы / тромбина.
Если механические повреждения планируется, важно использовать МПС с точной конструкции. Область, где поражение предназначен должен быть свободным от электродов, проволоки и изоляции. В противном случае, электрика МЭС будут повреждены, и поэтому ни одной записи не может быть выполнена больше.
Еще один важный шаг касается размера поражения. Было показано, что ранее повторном двух молодых ломтики после поражения занимает около двух дней 10. Для всех экспериментов, эмпирическое правило, что используют в космической betweан срезов после поражения не должны быть больше, чем ширина паза МЭС (300 мкм). Больший размер повреждения может привести к более длительный срок для повторного подключения или, если повреждение не является слишком большой, не переподключение вообще. Для аннотирования, бывшие эксперименты показали, что начальная установка из двух ломтиков дальше, чем 1 мм в результаты очень низкой скорости соединения.
Перед началом записей, временем регулировки, по меньшей мере 10 мин до комнатной температуры, вместо 37 ° C инкубатора и с внеклеточным раствором, вместо питательной среде рекомендуется. Тщательное наблюдение картины деятельности в течение этих начальных минут гарантирует, что измеренные данные представляют разрывной образец культуры надлежащим после записи был начат.
Для обнаружения активности, сбора данных и дальнейшей обработки, домашнее метизы (запись камеры, подключение к усилителям и усилителей), программы в ЛабораторииВЗГЛЯД, С ++ и IgorPro используются. Коммерческие MEA настройки и другие программные пакеты подходят также для этих операций. Здесь, сигналы видно электродами, усиливаются 1001 раз, а затем оцифрованы со скоростью 6 кГц.
Представленная модель может быть полезным инструментом для изучения проприоцептивных соединения, так как в естественных условиях, они трудны для изучения без вмешательства восходящих и нисходящих волокон трактаты. Совместное культивирование двух спинного мозга ломтиками может элегантно обойти этот вопрос. Культуры обеспечить микросреду, которые могут быть жестко контролируемой и легко манипулировать. С другой стороны, надостный и сенсорный вход, конечно, отсутствует. Кроме того, процесс подготовки культура представляет ситуацию поражения ЦНС. Глиальные клетки, такие как астроциты и микроглии, как известно, отвечают на поражений с повышенной пролиферацией и, следовательно, ткань в определенной степени реорганизованной. Относительно представленного режимел образование глиальных шрам после выполнения механические повреждения не наблюдалось. Одним из объяснений может быть, что адаптивные механизмы астроцитов уже срабатывает в процессе подготовки и поражений культур не приведет к дальнейшему ответ. Кроме того, нет никаких доказательств причастности миелиновых ингибиторов, связанных, например,., Nogo-A, в низкой регенеративного потенциала культур повреждениями в старости. Тем не менее, было показано, что лечение с фосфодиэстеразы 4 ингибитора Ролипрам, начиная непосредственно после выполнения поражений на 23 DIV увеличивает функциональную регенерации между кусочками 10. Эти результаты показывают, что функциональное восстановление может быть увеличена в старых культур. Заметно, при подсчете количества аксонов, пересекающих поражения сайт, не было обнаружено никакой разницы между культурами повреждениями в молодом возрасте и культур повреждениями в старости. Эти данные свидетельствуют о том, что отсутствие регенерации аксонов не главная причина еили потеря восстановления после поражений в конце культуры и, следовательно, подчеркнуть необходимость для модели, что позволяет функциональный анализ регенерации. Формирование синапсов и синаптической пластичности могли бы играть важную роль в процессе восстановления 10. Эти механизмы получили много внимания в последние годы, и это в настоящее время широко признается, что они имеют большое влияние на исход после повреждения спинного мозга. Таким образом, модель, которая обеспечивает стабильные условия для расследования этих процессов в изоляции и в мельчайших подробностях, безусловно, может помочь получить представление о функциональной регенерации спинного мозга.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |