هنا نقدم البروتوكول الذي يقوم على شرائح النخاع الشوكي مثقف على صفائف متعدد القطب لدراسة تجديد الوظيفي للاتصالات نخاعي مخصوص في المختبر.
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
وقد استخدمت الثقافات شريحة عضوي النمط من الجهاز العصبي المركزي (CNS) على نطاق واسع لدراسة مختلف الظواهر الفسيولوجية والمرضية تمتد من تطوير الخلايا العصبية في التنكس العصبي. مقارنة مع ثقافات الخلية فصلها، وشرائح عضوي النمط توفر ميزة المزيد من التعقيد مع التهندس الخلوي سليمة والدوائر متشابك المحلية. وفي الوقت نفسه، يمكن تحليل الأنسجة بطريقة معزولة دون الحاجة إلى توريط تعقيد كله في سياق الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، هناك ما يبرر الوصول السهل والمتكررة لخلايا الاختيار، يمكن التحكم في البيئة خارج الخلية بدقة وعادة، في المختبر النماذج أقل تكلفة من نظرائهم في الجسم الحي. في السنوات الأخيرة، والدراسات المختلفة المعروضة أوجه الشبه بين ملامح التنموية الثقافات طويلة الأجل مقابل الحيوانات المقابلة يعيشون 1،2. وقد تبين أن الدوائر العصبية من مختلف CNS رجونانوثانية تعبر عن نشاط الشبكة عفوية خلال التنمية، وأن شرائح عضوي النمط حفاظ جزئيا هذه الظاهرة 3 -7. وقد استخدمت معزولة الاستعدادات الحبل الشوكي وخاصة للتحقيق في الجيل إيقاع 6 وتشكيل الدوائر العصبية 1.
وهناك طريقة لتسجيل النشاط العفوي من شرائح عضوي النمط هو ثقافة لهم على رأس صفائف متعدد القطب الأطراف. هذه الأجهزة تحتوي على أقطاب متعددة والتي يمكن رصد إمكانات خارج الخلية الناتجة عن إمكانات العمل من العديد من الخلايا في وقت واحد (تسجيل متعددة الوحدات). القرار زمنية عالية من التسجيلات MEA يمكن استخدامها لإعادة بناء ديناميكية النشاط دقيقة داخل الدوائر العصبية معين. بالإضافة إلى ذلك، وعلى النقيض من التصحيح، تحامل على تقنية هو غير الغازية، والذي يسمح القياسات طويلة الأجل والنتائج في حقيقة أن الخلايا العصبية لا تتأثر في سلوكهم.
Fأو الغرض من هذه الدراسة، تم استخدام مزيج من عضوي النمط الحبل الشوكي المشترك الثقافات والتسجيلات متعددة المواقع للتحقيق تجديد وظيفية داخل الحبل الشوكي. منذ الكبار الفقاريات العليا والقدرة على التعافي من الضرر من الحبل الشوكي محدودة، وقد درس استراتيجيات مختلفة لتشجيع تجديد بعد إصابة الحبل الشوكي. حتى الآن، وقد الجهاز القشري عادة في النظام النموذجي لاختيار لمثل هذه التحقيقات. هذه التجارب عادة ما تكون مضيعة للوقت ومكلفة وتتطلب الأفواج الحيوانات الكبيرة بسبب التباين الشديد ضمن مجموعات واحدة. وعلاوة على ذلك، تشير الدلائل إلى أن الاتصالات نخاعي مخصوص (الخلايا العصبية التي تقتصر تماما داخل الحبل الشوكي) يمكن أن تلعب دورا محوريا في عملية الانتعاش في أعقاب آفات الحبل الشوكي 8. هذه الألياف هي صعبة للدراسة في الجسم الحي دون تدخل تصاعدي وتنازلي مساحات الألياف. بونيسي وKapfhammer 9 يستخدم الحبل الشوكي الطوليالثقافات شريحة من الفئران بعد الولادة كنهج بديل. بعد أداء الآفات الميكانيكية حللوا شبه كمي لتجديد الصرفي من المحاور بين شرائح النخاع الشوكي. لاحظوا أقل ولكن ليس المحاور أيا عبور موقع الآفة في الثقافات قطع في سن ناضجة. في المقابل، الثقافات التي تم lesioned في مرحلة الشابة عرضها على كمية عالية من تجدد المحاور 5 – 7 أيام بعد الضرر. ومع ذلك، لم يعرض دليل للاتصالات وظيفية.
ولذلك، فإن وضع ممثل في نموذج المختبر من الألياف نخاعي مخصوص التي تسمح التحقيق في تجديد وظيفية يمكن أن يكون أداة قيمة لتوسيع معرفتنا حول عمليات التجدد في النخاع الشوكي.
عدة عناصر في الإجراء قدم أساسية لإنجاز تجارب دقيقة وقابلة للتكرار. يتم تنفيذ جميع الخطوات أثناء إعداد الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف والحلول وإنتاج الثقافات شريحة تحت ظروف معقمة في غطاء تدفق الصفحي. لا يتم تطبيق المضادات الحيوية للوسط الغذائي لأنها يمكن أن تؤثر على النشاط العفوي 14. خلال طلاء MEA، والجزء الأهم هو التأكد من أن الخلية حل هلام مصفوفة يبقى باردا في جميع الأوقات. ذوبان الجليد في الثلاجة ويبقيه على الجليد لمدة الإجراء بأكمله لضمان درجة الحرارة القصوى قريبة من 0 درجة مئوية. أثناء إعداد شرائح العزل سريعة وباجتزاء، وكذلك الالتفات إلى درجة حرارة منخفضة باستخدام الثلج مخازن تشريح الباردة يزيد من نسبة ثقافات صحية. وعلاوة على ذلك، البلازما / ثرومبين التخثر هي واحدة من أهم الخطوات. أولا، تأكد من أن البلازما هي الورقة و صحيحد مع ثرومبين. الثانية، وإيلاء اهتمام خاص لإزالة أكبر قدر ممكن من بقايا ممكن لضمان التعلق الصحيح للشرائح على الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف. هذه الخطوة هي غاية الحساسة للوقت. إذا كانت الفترة الزمنية قصيرة جدا، وإزالة الكثير من الخليط البلازما / ثرومبين. إذا كان إطار زمني طويل جدا، تخثر حدث بالفعل، مما يزيد من مخاطر إزالة شرائح جنبا إلى جنب مع المتبقية البلازما / ثرومبين.
إذا تم التخطيط الآفات الميكانيكية، فمن المهم استخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف مع تصميم دقيق. المنطقة حيث يهدف الآفة يجب أن تكون خالية من الأقطاب الكهربائية وأسلاك والعزل. خلاف ذلك، والكهربائية من شركة طيران الشرق الأوسط تسير للتلف وبالتالي، لا يمكن أن يؤديها التسجيلات بعد الآن.
خطوة حاسمة أخرى تتعلق حجم الآفة. وقد تبين أنه سبق أن إعادة توصيل شريحتين الشباب بعد الآفة يستغرق حوالي يومين 10. لجميع التجارب، تم استخدام بحكم التجربة أن betwe الفضاءأون شرائح بعد الآفة لا ينبغي أن يكون أكبر من عرض الأخدود MEA (300 ميكرون). A حجم أكبر آفة قد يؤدي إلى فترة زمنية أطول لإعادة الاتصال أو، إذا كان آفة كبيرة جدا، لا إعادة الاتصال على الإطلاق. لتعليم، وكشفت التجارب السابقة أن وضع الأولي للشرائح اثنين أبعد من 1 مم النتائج في سرعة الاتصال منخفض جدا.
قبل بداية التسجيلات، وقت التعديل لا يقل عن 10 دقيقة لRT، بدلا من 37 درجة مئوية في الحاضنة، وإلى حل خارج الخلية، بدلا من وسيلة التغذية الموصى بها. مراقبة وثيقة من نمط النشاط خلال هذه الدقائق الأولية يضمن أن البيانات المقاسة تمثل نمط انفجار الثقافة بشكل مناسب بعد أن بدأ تسجيل.
للكشف عن النشاط، الحصول على البيانات ومزيد من المعالجة، والأجهزة المنزلية (غرفة تسجيل، وصلات إلى مكبرات الصوت ومكبرات الصوت)، وبرامج في مختبرVIEW، تستخدم C ++ وIgorPro. هي مناسبة الاجهزة MEA التجارية وحزم البرامج الأخرى فضلا عن هذه العمليات. هنا، وتتضخم الإشارات التي اطلعت عليها الأقطاب 1001 مرات، ثم رقمنة بمعدل 6 كيلو هرتز.
يمكن للنموذج المقدم أن تكون أداة مفيدة لدراسة الاتصالات نخاعي مخصوص لفي الجسم الحي، فهي من الصعب دراسة دون تدخل تصاعدي وتنازلي مساحات الألياف. للزراعة المشترك للشريحتين الحبل الشوكي يمكن أن تلتف بأناقة هذه المسألة. ثقافات توفر المكروية التي يمكن السيطرة عليها بإحكام والتلاعب بها بسهولة. من ناحية أخرى، ومدخلات فوق الشوك والحسي هو بطبيعة الحال في عداد المفقودين. بالإضافة إلى ذلك، فإن عملية إعداد الثقافة تمثل حالة تلف الجهاز العصبي المركزي. ومن المعروف أن الخلايا الدبقية النجمية مثل والخلايا الدبقية الصغيرة للرد على الآفات مع زيادة انتشار وبالتالي، والنسيج هو إلى حد ما أعيد تنظيمها. تتصل وضع قدملم يكن لوحظ لتر تشكيل ندبة الدبقية بعد أداء الآفات الميكانيكية. يمكن أن يكون تفسير واحد أن آليات التكيف من الخلايا النجمية وقد أثار بالفعل أثناء عملية إعداد والآفات من الثقافات لم يسفر عن رد آخر. أيضا، لا يوجد أي دليل على تورط المايلين مثبطات المرتبطة بها، على سبيل المثال، Nogo-A، في إمكانية تجديد منخفضة من الثقافات lesioned في سن الشيخوخة. ومع ذلك، فقد تبين أن المعاملة مع مثبطات الفوسفو 4 Rolipram، بدءا مباشرة بعد أداء الآفات في 23 DIV التجديد زيادات الوظيفي بين شرائح 10. وتبين هذه النتائج أن الانتعاش وظيفية قابلة للزيادة في الثقافات القديمة. بشكل ملحوظ، عندما عد عدد من المحاور عبور موقع الآفة، تم اكتشاف أي اختلاف بين الثقافات lesioned في سن مبكرة والثقافات lesioned في سن الشيخوخة. وتشير هذه النتائج إلى أن عدم وجود تجدد المحاور ليست هي السبب و الكبرىأو فقدان الانتعاش بعد الآفات المتأخرة في الثقافة وبالتالي التأكيد على الحاجة إلى نموذج الذي يسمح التحليل الوظيفي للتجديد. تشكيل متشابك واللدونة متشابك يمكن أن تلعب دورا رئيسيا في عملية الانتعاش 10. اكتسبت هذه الآليات على الكثير من الاهتمام خلال السنوات الأخيرة، وهذه الأيام مقبولة على نطاق واسع أن لديهم تأثير كبير على نتائج بعد إصابة الحبل الشوكي. لذلك، يمكن للنموذج الذي يوفر ظروف مستقرة للتحقيق في هذه العمليات في عزلة وبقدر كبير من التفصيل يساعد بالتأكيد للحصول على فكرة عن تجديد وظيفية في الحبل الشوكي.
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |