在这里,我们提出了一个协议,基于多电极阵列培养来研究在体外 propriospinal连接官能再生脊髓切片。
Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings.
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.
中枢神经系统(CNS)的器官切片文化已被广泛用于研究各种生理和病理现象达到从神经发育神经退行性病变。相比解离的细胞培养物,器官切片提供的更多的复杂性的优点具有完整细胞结构和本地突触电路。同时,可将组织在一个孤立的方式,而不需要牵连整体的复杂体内上下文进行分析。此外,容易和反复获取所选择的细胞是必要的,细胞外环境,可以精确地控制,通常, 在体外模型比其在体内的对应成本更低。近年来,各种各样的研究提出了长期培养物随相应活体动物1,2的发育轮廓之间惊人的相似。它已被示出的各种中枢神经系统区域选择性的那个神经元回路在开发过程中NS表达自发的网络活动和器官切片部分保持这一现象3-7。分离的脊髓制剂已被特别用于研究节奏产生6和神经元回路1的形成。
一种方法来记录器官切片的自发活动是培养他们多电极阵列(多边环境协定)的顶部。这些设备包含多个电极,可以监控通过动作电位从众多的细胞同时(多单位记录)所产生的外势。在MEA记录的高时间分辨率可用于在给定的神经元回路重构精确活性动力学。此外,相对于膜片钳技术是非侵入性的,这允许在一个事实,即神经元不受在他们的行为长期测量和结果。
F或本研究的目的,器官脊髓共培养物和多站点记录的组合被用来研究在脊髓内的功能再生。由于成人高等脊椎动物具有有限电位从脊髓的损伤中恢复过来,不同的策略进行了研究,以促进脊髓损伤后再生。到目前为止,皮质脊髓束处往往是首选的模型系统这样的调查。这些实验通常是费时的,昂贵的,并需要大的动物同伙由于单个组内的高变异性。此外,有证据表明propriospinal连接(即完全在脊髓内的神经元限制),可以起到恢复过程以下脊髓病变8举足轻重的作用。这些纤维难以在体内研究无升降纤维束的干扰。邦尼奇和Kapfhammer 9用纵向脊髓出生后的小鼠作为一种替代办法切片文化。执行机械损伤后,他们分析了半定量脊髓节段之间的轴突的形态再生。他们观察到的较少,但不是没有轴突穿越病变部位在文化切成一个成熟的年龄。损坏后7天 – 与此相反,损伤在年轻的阶段,文化5显示的大量轴突再生的。然而,证明功能的连接并没有出现。
因此 ,在propriospinal纤维体外模型的代表的发展,使功能再生的调查可以是一个有价值的工具来扩展有关在脊髓再生过程我们的知识。
所呈现的过程中的一些内容是根本,准确的和可重复的实验成果。在无菌条件下在层流罩中进行制备的多边环境,溶液和生产的切片培养的过程中的所有步骤。抗生素不施加到营养培养基中,因为他们可影响自发活动14。期间在MEA涂层中,最重要的部分是,以确保外基质凝胶溶液在所有时间保持冷。解冻在冰箱并使其保持在冰上的整个过程,以确保一个最高温度接近0℃。在切片的快速分离和切片的制备,以及注意于低温使用冰冷夹层缓冲器增加健康培养物的百分比。此外,等离子/凝血酶凝结是最重要的步骤之一。首先,请确保等离子是正确混用ð有凝血酶。其次,要特别注意去除尽可能多的残留物尽量保证切片的多边环境协定的正确连接。这一步是非常时间敏感;如果时间帧太短,太多的等离子体/凝血酶混合物被除去。如果时间帧太长,凝固已经发生,增大沿与残留血浆/凝血酶除去切片的风险。
如果机械病变计划,为使用多边环境与一个精确的设计是很重要的。的病变预定的面积需要是自由的电极,导线和绝缘。否则,该MEA的电气将要损坏,因此,没有录音可以再执行。
另一个关键的一步涉及到病变的大小。它先前已表明,损伤后重新连接两个年幼的片需要两天左右10。对于所有的实验中,经验法则所使用的空间betwe恩损伤后切片应不大于MEA槽(300微米)的宽度。一个更大的病变的大小可能会导致重新连接一个较长的时间框架,或者,如果病变太大,不重新连接的。注释,前实验揭示的初始放置的两片远于1毫米导致非常低的连接速率。
录音代替培养箱37℃,至少10分钟至RT的调整时间,开始前,向细胞外溶液中,而不是营养介质的建议。在这些初始分钟密切观察活动模式的确保所测量的数据所代表的文化的记录开始后适当的破裂图案。
对于活动,数据采集和深加工的检测,自制的硬件(录音室,连接到放大器和放大器),在实验室方案VIEW,C ++和IgorPro使用。商业MEA设置和其他软件包适合以及进行这些操作。这里,看到的电极的信号被放大1001倍,然后进行数字化以6KHZ的速率。
该模型可以是一个有用的工具来检查propriospinal连接,因为在体内 ,它们很难不升降纤维束的干扰学习。在共同培养两脊髓切片可以优雅地绕过这个问题。将培养提供可以严格控制,并容易操纵的微环境。另一方面,脊髓上和感觉输入是当然的缺失。此外,将培养制备过程表示的CNS损伤的情况。胶质细胞样星形细胞和小胶质细胞是已知的病灶具有增加的增殖,因此响应,组织是在一定程度上进行了重组。关于所呈现的模式没有观察到升执行机械损伤后一胶质瘢痕的形成。一种解释可能是,星形胶质细胞的适应机制在制备过程中已经触发了培养物的病变不导致进一步的响应。此外,也没有证据表明髓鞘相关抑制剂的参与, 例如 ,的Nogo-A,在文化损毁在一个旧时代的低再生潜力。然而,已显示与磷酸二酯酶4抑制剂咯利普兰,切片10之间执行病变在23格增加官能再生后直接开始治疗。这些结果表明,功能恢复可以在旧培养物增加。值得注意的是,计算轴突穿越病变部位的数量时,文化损毁在年轻的时候和文化的损毁,在老年间无差异被发现。这些结果表明,缺乏轴突再生的不是主要原因˚F或回收的晚期损伤培养后的损失,因此强调需要一个模型,它允许再生的功能分析。突触的形成和突触可塑性可以发挥在恢复过程中10了重要作用。这些机制得到了很多的关注最近几年,这是时下普遍认为他们有脊髓损伤后对结果产生重大影响。因此,一个模型,提供稳定的条件下,以调查这些进程隔离和非常详细当然可以帮助,以获取有关脊髓功能恢复的洞察力。
The authors have nothing to disclose.
This study was supported by the Swiss National Foundation (n° 3100AO-120327 and 31003A_140754/1)
Planar multielectrode array | Qwane Biosciences | custom-made according to the design of our lab | |
Nutrient medium | For 100 ml | ||
Dulbeccos modified Eagle's medium | Gibco | 31966-021 | 80 ml |
Horse serum | Gibco | 26050-070 | 10 ml |
distilled, sterile water | 10 ml | ||
Nerve growth factor-7S [5ng/mL] | Sigma-Aldrich | N0513 | 200 µl |
reconstituted in wash solution with 1% BSA | |||
Coating solution | |||
Extracellular matrix gel | BD Biosciences | 356230 | Must stay cold at all times; dilute 1:50 with medium optimized for prenatal and embryonic neurons |
medium optimized for prenatal and embryonic neurons | Gibco | 21103-049 | |
Wash solution | [mg/L] | ||
MgCl2-6H2O | 100 | ||
MgSO4-7H2O | 100 | ||
KCl | 400 | ||
KH2PO4 | 60 | ||
NaCl | 8000 | ||
Na2HPO4 anhydrous | 48 | ||
D-Glucose (Dextrose) | 1000 | ||
According to the protocol on http://www.lifetechnologies.com/ch/en/home/technical-resources/media-formulation.152.html | |||
Extracellular solution (pH 7.4) | [mM] | ||
NaCl | 145 | ||
KCl | 4 | ||
MgCl2 | 1 | ||
CaCl2 | 2 | ||
HEPES | 5 | ||
Na-pyruvate | 2 | ||
Glucose | 5 | ||
Blocking Solution | |||
Detergent: Triton X-100 | 0.3%, harmful if swallowed | ||
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418 | 1% |
Goat serum | Gibco | 16210-064 | 5% |
Chicken Plasma | Sigma-Aldrich | P2366 | Lyophilized, reconstitute with wash solution |
Gabazine | Sigma-Aldrich | SR-95531 | |
Mecamylamine hydrochloride | Tocris | 2843 | toxic if swallowed |
Micropipette | World Precision Instruments, Inc. | MF28G-5 | |
Paraformaldehyde | harmful, 4% | ||
SMI-31 | Covance | SMI-31P | |
SMI-32 | Covance | SMI-32R-500 | |
Strychnine | Sigma-Aldrich | S0532 | toxic |
Thrombin | Merck Millipore | 1123740001 | irritant, sensitizing, reconstitute with wash solution |
Tissue culture flat tube 10 (= roller tube) | Techno Plastic Products AG | 91243 |