In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Por muitos anos, a investigação sobre doenças neurodegenerativas, como acidente vascular cerebral isquêmico ou lesão cerebral traumática tem-se centrado no desenvolvimento de terapias neuroprotetoras que visam promover a sobrevivência neuronal na fase aguda acidente vascular cerebral. A grande maioria de drogas terapêuticas que têm sido encontrados para ser eficaz em modelos de roedores com falha quando traduzida para a clínica. As razões para esta falha terapêutica incluem, mas não se restringem à falta de efeitos de drogas sustentadas resultando na persistência da recuperação neurológica funcional. Assim, é importante para desenvolver estratégias que promovam a remodelação do cérebro no longo prazo. Como a promoção de sobrevivência neuronal por si só não é suficiente para permitir a recuperação bem-sucedida do curso, tal como sugerido pelo grande número de tentativas mal sucedidas de neuroproteção, a estimulação de plasticidade neuronal recentemente obteve grande interesse no campo.
Meios para a entrega da droga são a injeção intraperitoneal, cauda i intravascularnjection, injecção femoral, a injecção estereotáxica de vectores única no cérebro e continuou entrega constante por bombas mini-osmóticas. Estes últimos podem incluir a entrega sistémica, se a bomba não tem uma cânula, ou que pode ser dirigido órgão, como mostramos para entrega no cérebro. Com a excepção das bombas mini-osmóticas e a utilização de vectores virais, todas as outras estratégias irá induzir concentrações de droga flutuantes. Para os experimentos de longa duração torna-se, assim, necessário apresentar o animal ao estresse de receber injecções frequentes. O BBB impõe um obstáculo importante para a captação no cérebro de proteínas ou fármacos a partir do sangue, resultando na necessidade de grandes dosagens de proteína ou de drogas, a fim de atingir as concentrações terapêuticas no cérebro. Por exemplo Pellegrini et al. (2013) 5 entregue rhEpo por injecção intraperitoneal com uma dose equivalente a 75 IU / dia para um animal, de 30 g (750 UI / dia para um rato de 300 g). Em comparação, a entrega de rhEp alvoo para o cérebro nos permitiu usar uma dose muito menor de apenas 10 IU / dia em nosso estudo para recuperação bem sucedida do curso, o que nos permitiu conseguir a recuperação através de uma escala de tempo grande em uma taxa fixa de 0,25 l / h.
Neste trabalho, demonstraram que o método de implantação de mini-bombas com uma cânula ligada ao crânio, a fim de proporcionar a proteína de promover plasticidade rhEpo directamente no ventrículo, contornando assim a certificação. Por este método, rhEpo promoveu a recuperação neurológica em um número de maneiras, incluindo a redução do tamanho do enfarte, a redução da formação de cicatrizes gliais e a indução da angiogénese. rhEpo também promoveu a sobrevivência neuronal e aumento projeções do córtex motor contralesional para o núcleo vermelho desnervado e núcleos faciais. O surgimento das fibras foi revelado por injecção do traçador tracto anterógrada BDA no córtex motor (Figuras 4A e 5A). Um correlato funcional para o surgimento das fibras é provided pela melhora das habilidades motoras (Figura 5B). Além disso, mostrámos que a mesma abordagem para injecção tracto traçador pode ser aplicado para revelar ligações tálamo-corticais por injecção do traçador retrógrado tracto FG (Figura 6B).
Na preparação da bomba mini-osmóticas, é importante considerar o ponto-alvo e a utilização de espaçadores. Usamos um espaçador para reduzir o comprimento da agulha por 0,5 milímetros como, desta forma a ponta da agulha está em contacto com o ventrículo nas coordenadas indicadas (-0,2 mm caudal, 0,9 mm lateral, 2,5 mm ventral dorso, com relação ao bregma). No entanto, se estruturas mais profundas são o alvo da pesquisa, em seguida, será necessária sem espaçadores. Da mesma forma, se um ponto de distribuição mais externa é desejada (isto é., O córtex), em seguida, mais discos espaçadores será necessário. O cateter deve ser longa o suficiente para que a bomba não é muito perto da cabeça, uma vez que irá impedir o movimento do mouse, mas também comprimento excessivo não muito tempo, como uma vez implantado pode fazer com que o cateter de dobrar, aumentando assim o risco de a remoção da cânula pela circulação natural do rato. A secção de 2 cm de cateter dá muito bons resultados em termos de mobilidade e estabilidade do implante (Figuras 1 e 2). A incubação da bomba a 37 ° CO / N permite que a bomba comece imediatamente a bombear o fármaco no cérebro, no momento da implantação.
No implante de bomba mini-osmóticas é crítico para assegurar que o crânio é bem seco antes da implantação da cânula. Normalmente, a limpeza com 70% de etanol, vai induzir o osso para secar, mas se a hemorragia contínua é encontrado, tocando o crânio suavemente com um cauterizador vai secar completamente. É crítico para assegurar que a introdução da agulha é como vertical e lenta quanto possível. Uma vez em posição, e ao mesmo tempo a cola está a secar, colocando o dedo no topo da cânula impede que se mova lateralmente OVer o crânio. Cuidado especial deve ser dado à ferida e colocação da cânula. É importante que a incisão não é realizada exactamente sobre a linha média do crânio, mas ligeiramente para o lado direito. Ao fechar a ferida, se a incisão na linha do meio, a pele será sobrecarregado, aumentando assim o risco de abertura da ferida. Fazer a incisão ligeiramente para um lado vai permitir que os pontos de sutura para ser longe da parte mais alta da cânula. Como consequência, haverá menos tensão sobre os pontos de sutura e a ferida irá curar devidamente. Os animais devem ser enjaulado sozinho verificado todos os dias, especialmente durante os primeiros 10-15 dias após a implantação. Em caso de deiscência da ferida, as feridas tem que ser fechado tão rapidamente quanto possível. Se a cânula for removida ou o animal apresenta uma infecção, a experiência tem que ser terminado. Re-implantação da cânula não é recomendado. É muito importante para o sucesso da implantação a utilização de quantidades adequadas de tecido anúncioadesiva (não muito!), uma vez que degrada o osso e aumenta o risco de a remoção de uma cânula. No entanto usando muito pouco adesivo também não vai segurar a cânula ligado ao osso. As bombas mini-osmóticas podem transportar drogas dissolvidas em uma ampla variedade de substâncias, sendo a única limitação a isto que o solvente é biocompatível. Além disso, dado que o volume é pequeno (200 ul) deve-se determinar se a concentração necessária para a experiência é adequado e não irá provocar a precipitação dentro da bomba.
Rastreamento com qualquer anterógradas ou retrógradas traçadores trato é uma técnica muito bem estabelecido para estudar a conectividade cerebral e plasticidade. Cuidados devem ser tomados para os quadros uso estereotáxica quando se injecta para garantir a precisão na segmentação a área do cérebro que se deseja estudar (ou seja, para evitar a injeção no corpo caloso ao injetar o córtex).
Para todas as intervenções cirúrgicas e de modo a reduzir a dor einflamação, os animais devem ser tratados com 0,1 mg / kg de buprenorfina antes da intervenção e Caprofen a 4 mg / kg uma vez por dia durante três dias após a intervenção.
Em conclusão, esta abordagem proporciona uma ferramenta adequada para o estudo de efeito de proteínas ou compostos farmacológicos no cérebro lesionado, que representa um método que é bem adequado para estudos sobre a plasticidade do cérebro.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |